RESUMEN
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), es
un factor clave en la angiogénesis tumoral de muchos
tipos de tumores, incluyendo el Linfoma No Hodgkin
(LNH). El objetivo del presente trabajo es la radiomar-
cación de los fragmentos de unión al antígeno (Fab) del
99m
anticuerpo monoclonal Bevacizumab con Tc y su
evaluación como potencial agente de imagen para LNH.
Para lograrlo se analizó la expresión de VEGF mediante
citometría de flujo en una línea celular de LNH (Toledo).
La fragmentación se realizó empleando papaína y los
Fab obtenidos fueron conjugados con NHS-HYNIC-Tfa y
99m
radiomarcados con Tc. La pureza radioquímica y la
estabilidad fueron ensayadas. Se realizaron estudios de
biodistribución tanto en ratones sanos como en
portadores de LNH. Se observó que las células Toledo
presentaron una elevada expresión de VEGF. El
radiomarcaje se realizó de forma rápida, sencilla,
reproducible y estable, con purezas radioquímicas
>90%. Los estudios de biodistribución revelaron una
significativa captación renal y tumoral, indicando que la
principal vía de eliminación es renal. De los resultados
99m
obtenidos se concluye que el Tc-HYNIC-Fab
(Bevacizumab) representa un potencial a agente de
imagen de la expresión de VEGF asociada a LNH.
PALABRAS CLAVE: Linfoma No Hodgkin, VEGF, Fab
99m
(Bevacizumab), Tc, HYNIC, Angiogénesis Tumoral.
ABSTRACT
Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a key factor
in tumor angiogenesis in numerous types of tumors,
including Non-Hodgkin Lymphoma (LNH). The objective
of this paper is the radiolabeling of antigen-binding
fragments (Fab) of the Bevacizumab monoclonal
99m
antibody with Tc and its assessment as a potential
imaging agent for LNH. In order to achieve this, it was
analyzed the VEGF expression with flow cytometry in an
LNH (Toledo) cell line. Fragmentation was carried out
with papain and Fab obtained were conjugated with NHS-
99m
HYNIC-Tfa and labeled with Tc. Radiochemical purity
and stability were tested. Biodistribution studies were
performed in healthy mice and in LNH carriers as well. It
was observed that Toledo cells showed a high VEGF
expression. Radiolabeling was completed in a quick,
easy, duplicable and stable manner, with radiochemical
purities >90%. Biodistribution studies revealed a
significant kidney and tumor accumulation, showing that
the kidney clearance route is the most important one.
99m
From the obtained results, it is concluded that the Tc-
HYNIC-Fab (Bevacizumab) represents a potential
imaging agent for VEGF expression associated to LNH.
KEY WORDS: Lymphoma, Non-Hodgkin, VEGF, Fab
99m
(Bevacizumab), Tc, HYNIC, Tumor Angiogenesis
1. INTRODUCCIÓN
El linfoma no Hodgkin (LNH) es la neoplasia hemato-
lógica más frecuente y quinta causa de muerte por
cáncer en el mundo, más del 90% tiene origen en
linfocitos B (1). Se sabe qué proceso de la angiogénesis
es fundamental para el desarrollo tumoral y se encuentra
regulado por la expresión de factores pro-angiogénicos,
en especial por el factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF) (2). Esta sustancia es una glicoproteína
producida tanto por las células normales como las
neoplásicas, jugando un rol muy importante en situa-
ciones fisiológicas como patológicas (3).
ARTÍCULOS ORIGINALES
99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab): potencial agente
de imagen para diagnóstico de Linfoma No Hodgkin
Doi: http://dx.doi.org/10.35954/SM2017.36.2.2
Carolina Perronia, MSc. Ximena Camachoa, María Fernanda Garcíaa, Marcelo Fernándeza,
Hugo Cerecettoa, Juan Pablo Gambinib, Eloisa Rivac, Pablo Cabrala
(a) Departamento de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias,
Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
(b) Centro de Medicina Nuclear, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina,
Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
(c) Cátedra de Hematología, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina,
Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
.
Recibido: Agosto 2017
Aceptado: Octubre 2017
Correspondencia: : Laboratorio de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República,
Montevideo, Uruguay. Mataojo 2055, P.O. 11400, Montevideo, Uruguay. Tel.: (+5982) 5250901/108; Fax: (+5982) 5250895
E-mail de contacto: pcabral@cin.edu.uy
Salud Militar 2017; 36(2):14-24
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Salud Militar 2017; 36(2):14-24
99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab): potencial agente de imagen para diagnóstico de Linfoma No Hodgkin
Existen cada vez más evidencias que la angiogénesis
tumoral juega un rol muy importante en las neoplasias
hematológicas; relacionado a este proceso con eventos
adversos y comportamientos clínicos muy agresivos en
linfoma maligno. Sin embargo, el rol de la angiogénesis
podría variar según los distintos subtipos de linfoma,
debido a los valores de densidad microvascular y de la
expresión de moléculas relacionadas con la angiogé-
nesis, los cuales difieren entre los distintos subtipos de
linfomas (4). En el caso de LNH, se ha observado una
densidad microvascular incrementada que se encuentra
fuertemente asociada, con las variantes más malignas
de esta enfermedad (4,5). El grupo de Wang y col. fueron
los primeros que examinaron el proceso de la angiogé-
nesis en LNH, mediante técnicas in-vivo e in-vitro (6),
revelando que las células de linfoma humanas demás de
secretar VEGF expresan sus receptores (VEGFR-1
como -2); apoyando una ruta autócrina para VEGFR-1 y
parácrina para VEGFR-2 en el proceso de la linfomagé-
nesis. Por lo tanto, es evidente la necesidad de estudios
que promuevan el desarrollo de nuevas opciones de
tratamiento y que sean eficaces en la lucha contra esta
enfermedad.
Sobre la base de su papel clave en la angiogénesis
tumoral, el eje VEGF/VEGFR ha llamado la atención en
la búsqueda de nuevas dianas tumorales, lo que se
explica por la gran variedad de agentes que están en
desarrollo y cuyo blanco es la señalización mediada por
VEGF. Por esta razón, es muy interesante utilizar
blancos contra el VEGF humano que puedan ser
manipulados como herramientas de imagen en estudios
preclínicos, conformando así como posibles blancos
para el mapeo del estímulo angiogénico en el microam-
biente tumoral. Una estrategia que se ha considerado en
oncología, es el uso de proteínas marcadas radiactiva-
mente con el fin de lograr monitorear las terapias
antitumorales así como de lograr comprender la
progresión e invasión tumoral (7). Todas las isoformas
del VEGF han sido y son blancos muy atractivos de
imagen, dado que proporcionan información, de una
forma no invasiva, del estado del VEGF local, y por lo
cual podrían ser útiles para guiar las terapias anti-
angiogénicas. Recientemente, la visualización tumoral y
la observación de los niveles de VEGF in-vivo tumoral
han sido posibles mediante el uso de la imagenología
molecular utilizando el VEGF (8-17).
Por lo anterior, se sabe que el VEGF es un factor
parácrino derivado de los tumores, dónde su expresión
es necesaria para la entrega de oxígeno y nutrientes para
el crecimiento tumoral, dónde su bloqueo ha sido clave
para el desarrollo de las denominadas estrategias anti-
angiogénicas. Unos de estos compuestos inhibidores del
VEGF desarrollados es el anticuerpo Bevacizumab,
anticuerpo monoclonal (AcMo) recombinante humaniza-
do contra el VEGF-A165 (rhu Mab VEGF) (18,19).
La gran disponibilidad en centros de Medicina Nuclear
convencionales, su química bien establecida con
adecuadas propiedades nucleares [t ½ = 6,04 h, Eγ = 140
KeV (89%)], hacen del tecnecio-99m un radionucleído
indicado para la síntesis de este tipo agentes de imagen,
aunado a su bajo costo (20,21). La química del marcado
99m
ya sea de péptidos como de proteínas con Tc de forma
directa o a través de agentes quelantes bifuncionales
(BFC) está bien establecida (21).
El empleo de AcMo radiomarcados dirigidos a antígenos
asociados al tumor con el fin de visualizar, caracterizar
y/o tratar el tumor, ha sido un área de intenso estudio
(22). Tanto en radioinmunoterapia como en imageno-
logía molecular, se requiere para su máxima efectividad
una elevada acumulación del AcMo radiomarcado a
nivel tumoral. Sin embargo presentan ciertas limitacio-
nes como lenta depuración sanguínea y de tejidos no
blanco asociadas a una alta captación hepática mediada
por la interacción de los receptores Fc sobre los
hepatocitos (disminuyendo la sensibilidad para
imágenes de metástasis hepáticas que es un sitio común
de diseminación tumoral). Es por ello que los fragmentos
de unión al antígeno (Fab) de los AcMo representan
adecuados candidatos como agentes de imagen, debido
a que presentan una rápida depuración sanguínea y de
tejidos no blanco, asociados a que no son secuestrados
por el hígado (23).
El objetivo del presente trabajo es la radiomarcación de
los fragmentos de unión al antígeno (Fab) del
99m
Bevacizumab con Tc vía el agente quelante bifuncional
HYNIC y su evaluación radioquímica y biológica como un
potencial agente de imagen preclínico para LNH.
16
Publicación de la DNSFFAA
2. METODOLOGÍA
2.1. Fragmentación del AcMo Bevacizumab
Bevacizumab (Avastin®) 25 mg/mL producido por
Genetech, Inc., fue proporcionado por Laboratorios
Roche.
La obtención de fragmentos Fab del Bevacizumab se
realizó en dos 2 etapas. En la primer etapa se realizó la
digestión de 5 mg del AcMo Bevacizumab empleando 0.5
mg de la enzima papaína(Sigma-Aldrich, relación 1:10)
ambas disueltas en buffer de digestión (10 mM EDTA, 80
mM L-Cisteína-HCl, pH 7). Dicha enzima proteolítica
provoca la ruptura de múltiples enlaces, en este caso es
empleada para escindir el AcMo por la región bisagra
para producir los fragmentos Fc y Fab del este. La
mezcla de reacción fue incubada a 37 ºC, a 225 rpm por
durante 24 h. Pasado el respectivo tiempo, la mezcla de
reacción fue centrifugada a 10000 rpm durante 10 min
empleando un Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters de
30 KDa. El concentrado obtenido se disuelve en buffer
fosfato salino (PBS, pH 7) y posteriormente se mide su
Absorbancia a 280 nm, para determinar la concentración
de proteína obtenida utilizando un coeficiente de
extinción molar de 1.45; con la siguiente fórmula:
Proteína (mg/mL) = Abs . Factor de dilución / E
280 280.
En la segunda etapa se realiza la purificación de los Fab
mediante el empleo de una columna de Proteína A
Agarosa (Thermo Fisher) equilibrada con PBS pH 7. Los
fragmentos Fab obtenidos son recolectados y se
determina su Absorbancia a 280 nm.
Como control del proceso de fragmentación se realizó
una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE
al 10 % en condiciones reductoras y no reductoras).
Como controles de calidad de los fragmentos obtenidos
se realizaron análisis por espectrometría de masa
(MALDI TOF/TOF, Abi Sciex) de adquisición lineal y
HPLC (Agilent 1200, Agilent Technologies, Italia)
utilizando una columna TSK-GEL 63000 SWXL 7.8 mm x
30 cm (TOSOHAAS), modo isocrático, buffer fosfato 0,05
M, pH 7.4, flujo 1 mL/min, equipado con detectores UV y
NaI(Ti).
2.2 Derivatización, marcación y controles de calidad
99m
de HYNIC-Fab(Bevacizumab)con Tc
La reacción de conjugación se inició por adición de 33 µL
de NaHCO 1M a 0.067 µmol de Fab(Bevacizumab)
3
purificados. Luego se añadió 0.33 µmol de Suc-HYNIC
en 7.1 μL DMSO (J. T. Baker). La mezcla se incubó a 18 –
25 ºC por 30 min en oscuridad, pH 8. El conjugado se
purificó, para separar el HYNIC libre, por cromatografía
de exclusión molecular utilizando una columna
Sephadex G-25 (SEC) (PD-10, Amersham Biosciences).
Se realizó MALDI-TOF/TOF para determinar la relación
de conjugación de HYNIC con los Fab(Bevacizumab).
Para lograr optimas condiciones de marcado, se disolvió
44.6 µmol de tricina (N-[Tris(hidroximethil)-metiyl]glicina,
Sigma) en 0.8 mL de agua, se ajustó el pH a 4.5 - 5 con
0,05 mL de HCl 2.0 M (solución A). En un segundo vial se
disolvió 44.3 µmols de SnCl2.2H2O (J. T. Baker) en 0.5
mL HCl 2.0 M y 0.05 mL de esta solución se adicionó al
vial de tricina. Finalmente se ajustó el volumen a 10 mL
con solución NaCl 0,9 % (solución B). 10 μL de la
solución B se adicionaron a 0.067 µmol de HYNIC-
Fab(Bevacizumab), e inmediatamente se agregó
99m 99 99m
Na TcO4 (Generador TecnoNuclear Mo- Tc), no más
de 1 mL. La mezcla de reacción se incubó a 37 °C
durante 30 min.
La pureza radioquímica (PRQ) fue evaluada utilizando
cromatografía de exclusión molecular (SEC). Además se
utilizaron distintos sistemas cromatrográficos ITLC-SG
99m
(Pall Corporation) y NaCl 0,9 % ([Rf=0, TcO2.H2O y
99m 99m
Tc-HYNIC-Fab(Bevcizumab)], [Rf=1, Tc-tricina y
99mTcO4-]); ITLC-SG embebida en albúmina de suero
bovino (BSA, Sigma-Aldrich) y EtOH:NH3:H2O (2:1:5)
99m 99m 99m 99m
([Rf=0, TcO2.H2O], [Rf=1 Tc-tricina, TcO4- y Tc-
HYNIC-Fab(Bevacizumab)]), y papel Whatman Nº1
99m
(Whatman International Ltd) y MEK ([Rf=0, TcO2.H2O,
99m 99m
Tc-tricina y Tc-HYNIC-Fab(Bevacizumab)], [Rf=1,
99mTcO4-]) como fases estacionarias y móviles respecti-
vamente. Los niveles de actividad se midieron luego de la
incubación en un contador de centelleo sólido Capintec
CRC7 con detector de cristal "3x3" de NaI(Tl) asociado a
un analizador multicanal ORTEC. También se evaluó la
PQR por HPLC.
99m
2.3 Estabilidad de Tc-HYNIC-Fab(Bevacizumab)
99m
La integridad de Tc-HYNIC-Fab(Bevacizumab) fue
analizado por medio de la incubación en 0.9% NaCl y
suero a 37ºC. Las mezclas de reacción fueron
analizadas por HPLC hasta 4 h.
17
Salud Militar 2017; 36(2):14-24
2.4. Ensayo de competencia con L-Cisteína
9 9 m
La estabilidad radioquímica del Tc-HYNIC-
Fab(Bevacizumab) fue analizado mediante un ensayo
de competencia, descrito por Hnatowich et al (24). El
ensayo se realizó mediante la incubación de 90 µL (3.7
99m
MBq) de Tc-HYNIC-Fab(Bevacizumab) con 10 µL de
L-Cisteína 1 y 10 mM (Sigma-Aldrich, USA), cuyas
concentraciones finales en la solución resultaron de 0.1 y
1 mM de L-Cisteína, respectivamente. Todas las
mezclas de reacción fueron incubadas a 37 ºC y
analizadas por HPLC hasta 4h.
2.5. Crecimiento de la línea celular Toledo
La línea celular humana Toledo originada a partir de
Linfoma difuso de células grandes (DLCL, subtipo de
LNH). La misma fue adquirida de la American Type
Culture Collection (ATCC). El medio base que se utilizó
para esta línea celular fue RPMI-1640 (ATCC), para
hacer que el medio de crecimiento sea completo se le
agregó al medio Suero Fetal Bovino (SFB) inactivado a
una concentración final de 10 % y 2 mM de L-glutamina.
El cultivo fue incubado a 37 °C con 5 % de Co .
2
2.6. Citometría de flujo empleando Fab(Beva-
cizumab)-FITC.
La capacidad relativa de unión al VEGF de los
fragmentos Fab del Bevacizumab conjugados a
Fluorescein isothiocyanate (FITC, Sigma-Aldrich) fue
evaluada en la línea celular Toledo.
Se emplearon como controles a las células Toledo sin
teñir como también un control de isotipo Ig de IgG1
humana conjugado a FITC (FITC-Isotipo) en la misma
concentración al fragmento marcado (2 ug). Dichos
controles permitirán controlar la tinción de fondo para
calcular las señales de fluorescencia relativas en
comparación con la señal de FITC-Fab(Bevacizumab).
5
Para llevar a cabo el ensayo, se resuspendieron 2 x 10
células Toledo en 100 uL de PBS-BSA 1% para cada
estudio (solo células, control isotipo y conjugado
marcado) por triplicado. Posteriormente se adicionaron a
las células tanto el control de isotipo como del conjugado
marcado, ambos disueltos en PBS-BSA 1% durante 1 h y
en oscuridad. En paralelo, pero previa a la adición tanto
del control de isotipo como del fragmento marcado, se
realizó la permeabilización de las células Toledo
mediante la adición de 100 ul de 0.5% Tween/PBS
durante 5 min. Por último las células de ambos ensayos
(sin permeabilizar como permeabilizadas) fueron
lavadas tres veces con PBS (5 min, 600×g) y los datos
fueron adquiridos empleando el citómetro de flujo
FACSCALIBUR® (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
2.7. Modelo animal
Se emplearon ratones machos Balb/c y hembras Balb/c
Nude, de 8-10 semanas (20-24 g), los cuales fueron
obtenidos del bioterio animal de la Universidad de la
República Oriental del Uruguay y del bioterio central de
la Facultad de Medicina-USP.
Para llevar a cabo la inducción tumoral en ratones Balb/c
Nude, se inyectaron de forma subcutánea las células
7
Toledo a una concentración 0.5x10 (con una viabilidad
de por lo menos 95%). Todos los procedimientos fueron
realizados según los principios éticos del Colegio
Brasilero de experimentación animal y aprobado por el
comité de ética de la Facultad de Medicina de San Pablo
(protocolo aprobado número 279/12).
Los ratones fueron mantenidos con agua y comida ad
libitum durante todo el tiempo de experimentación, en un
ambiente de temperatura y humedad controlado. Todos
los procedimientos que involucran animales fueron
aprobados por el Comisión Honoraria de Experimenta-
ción Animal local.
99m
2.8. Estudios de biodistribución con Tc-HYNIC-
Fab(Bevacizumab)
99m
La evaluación biológica in-vivo del Tc-HYNIC-
Fab(Bevacizumab) fue realizada mediante estudios de
biodistribución en ratones machos Balb/c y hembras
Balb/c Nude portadores de tumores LNH inducidos.
Animales (n=5 por grupo) fueron inyectados por la vena
99m
de la cola con aproximadamente 7.4 MBq del Tc-
HYNIC-Fab (Bevacizumab) y sacrificados por disloca-
ción cervical luego de 2, 6 y 24 h. Los tejidos
seleccionados (tumor, corazón, hígado, pulmones,
tiroides, riñones, estómago, bazo, tracto gastrointestinal
y vejiga) fueron extirpados, enjuagados de la sangre
residual, pesados y sus radiactividad medida en un
detector de NaI (Tl) anteriormente mencionado. La
sangre y orina fueron también colectados y medidos en
el contador gamma. La actividad de los órganos o tejidos
y tumoral fue expresada como porcentaje de actividad
(% Act) y como porcentaje de actividad por gramo de
tejido (% Act/g).
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Publicación de la DNSFFAA
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2.7. Análisis Estadístico
Los resultados se expresaron como media ± error
estándar. El análisis estadístico se realizó mediante la
prueba no apareada t. Fue considerado significativo un
valor de p ≤ 0,05.
3. RESULTADOS
3.1. Obtención de los fragmentos de unión al
antígeno (Fab) del Bevacizumab.
Para comprobar la efectiva digestión se realizó un
análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida al 10
% en condiciones reductoras y no reductoras. El la Figura
1 se aprecia que en condiciones reductoras (carriles 1 a
3) la presencia de una única banda tanto para al
anticuerpo entero Bevacizumab (carril 1, 150 kDa
aprox.), como de los fragmentos Fab del Bevacizumab
(carril 2, 50 kDa aprox.) y fragmentos Fab del anticuerpo
monoclonal Tocilizumab empleado como control (carril 3,
aprox 50 kDa). Por otro lado, en condiciones reductoras
(carriles 7, 8 y 9), en el caso del Bevacizumab (carril 7) se
lograron apreciar todas las bandas correspondientes a
un anticuerpo reducido; sin embargo en el caso de Fab
de Bevacizumab (carril 8) y Tocilizumab (carril 9)
únicamente se apreciaron dos bandas correspondientes
a los pesos moleculares de 50 y 25 kDa.
Figura 1. Análisis por SDS-PAGE al 10% en condiciones
no reductoras y reductoras. M: Marcador de peso mole-
cular; Carriles: 1) Bevacizumab, 2) Fab(Bevacizumab),
3) Fab(Tocilizumab), 7) Bevacizumab, 8) Fab(Bevacizu-
mab), 9)Fab(Tocilizumab).
A su vez se analizó el proceso de digestión mediante
MALDI-TOF y HPLC. Por MALDI-TOF se observó que la
relación m/z del Fab(Bevacizumab) puro fue de 47072.5,
(Figura 2).
Figura 2. Espectro de masa de Fab(Bevacizumab).
Por HPLC, los Fab obtenidos presentaron un tiempo de
retención (Rt) de 8.38 min (Figura 3).
Figura 3. Análisis por HPLC de Fab(Bevacizumab).
3.2. Derivatización, marcación y controles de calidad
99m
HYNIC-Fab(Bevacizumab) con Tc
Suc-HYNIC fue conjugado a los Fab purificados
obtenidos a temperatura ambiente por 30 min. Se
empleó una columna PD10 para separar el HYNIC-
Fab(Bevacizumab) conjugado del HYNIC libre. Más del
90% de la cantidad inicial de los fragmentos fueron
recuperados según lo que se monitoreo por absorbancia
UV a 280 nm usando un coeficiente de extinción molar de
1.4.
La relación m/z para el HYNIC-Fab(Bevacizumab) fue de
47173.5. Con las masas obtenidas por MALDI-TOF y
usando como referencia la masa de HYNIC, se
determinó que se une 1 molécula de HYNIC por molécula
de Fab (Figura 4).
19
Salud Militar 2017; 36(2):14-24
Figura 4. Espectro de masa de HYNIC- Fab(Bevaci-
zumab).
Las condiciones óptimas de marcado de HYNIC-
Fab(Bevacizumab) fueron determinados examinando
diferentes concentraciones de tricina y SnCl .2H O en la
2 2
reacción de marcado. La eficiencia de marcado de
fragmentos obtenido fue de 96.8 ± 2.4 % con una
relación de radio molar de tricina/SnCl 9:10. El
2
rendimiento de marcado fue confirmado por SEC y
99m
HPLC. El Tc-HYNIC-Fab(Bevaciuzmab) se eluyó a 3 –
99m 99m
4 mL y el TcO4- y Tc-Tricine libre a 7 – 8 mL en una
columna PD-10 con solución salina.
La caracterización por HPLC para HYNIC-Fab(Beva-
cizumab) revelaron un Rt de 8.35 min mediante
detección UV (Figura 5). A su vez se determinó el Rt para
99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab), el cual fue de 8.35
min por detección UV y de 8.28 min por detección
gamma (Figura 3A y 3B), no observándose otros picos
adicionales en el espectro gamma que pudiesen
corresponder a impurezas radioquímicas. A fin de
conocer y lograr determinar las identidades de estas
posibles impurezas radioquímicas se realizaron
99m
controles de TcO4- y Tricina libre revelando Rts de
13,15 y 12,38 min, respectivamente.
Figura 5. Espectro UV obtenido por HPLC para los
Fab(Bevacizumab)-HYNIC sin marcar. Rt = 8.35 min.
99m
Figura 6. A) Espectro UV obtenido por HPLC de Tc-
HYNIC-Fab(Bevacizumab), Rt. 8.35 min. B) Espectro
99m
gamma obtenido por HPLC de Tc-HYNIC-Fab(Beva-
cizumab), Rt = 8.28 min.
3.3. Estudios de estabilidad in-vitro
99m
Los estudios de estabilidad radioquímica de Tc-
HYNIC-Fab(Bevacizumab) revelaron que el marcado
fue estable por al menos 4 h en NaCl 0.9% y a 37ºC,
mostrando una pequeña variación de la integridad del
complejo de solo un 8 % a las 4 h mientras que en suero
se observaron modificaciones de la estabilidad de
aproximadamente un 5 % (Tabla 1).
99m
Para evaluar la cinética de Tc-HYNIC-Fab(Bevaci-
zumab) en condiciones fisiológicas, se llevó a cabo un
estudio de competencia por medio de la incubación del
conjugado marcado en distintas concentraciones de L-
Cisteína. Se observaron inestabilidades del complejo
marcado aproximadamente de 7 y 17 % luego de 4 h de
incubación con 0.1 y 1 mM de L-Cisteína, respectiva-
mente. Como control, todas las incubaciones se
realizaron simultáneamente comparando con la
incubación en NaCl 0.9% a 37°C (Tabla 1).
99m
Los datos de la Tabla 1 indican que Tc-HYNIC-
Fab(Bevacizumab) se mantiene relativamente estable
tanto en condiciones salinas como en suero, revelando
señales de degradación únicamente al incubarse el
complejo en cantidades importantes (gran exceso) del
ligando competidor. Se sabe que la L-Cisteína es un
ligando muy potente y que puede formar complejos muy
99m
estables con el Tc.
99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab): potencial agente de imagen para diagnóstico de Linfoma No Hodgkin
Publicación de la DNSFFAA
20
99m
Tabla 1. Estabilidad radioquímica in vitro de Tc-HYNIC-Fab(Bevacizumab) en 0,9% NaCl, suero, 0.1 y 1 mM de L-
Cisteína a 37ºC. Las medidas de HPLC fueron obtenidas con una columna TSK-GEL 63000 SWXL 7.8 mm x 30 cm
(TOSOHAAS), modo isocrático, buffer fosfato 0,05 M, pH 7.4, flujo 1 mL/min,, equipado con detectores de absorbancia
UV y de centelleo NaI(Tl).
3.4. Análisis por Citometría de flujo en la línea celular Toledo con FITC-Fab(Bevacizumab)
En la Figura 7 se observan los histogramas respectivos de los análisis por citometría de flujo tanto de las células sin
permeabilizar (Figura 7.A) como permeabilizadas con Tween (Figura 7.B) empleando FITC-Fab(Bevacizumab). Se logró
observar el aumento de la capacidad de unión de FITC-Fab(Bevacizumab) al VEGF al ser permeabilizadas las células en
comparación a las células sin permeabilizar; verificando de esta forma que dicha línea celular podría ser un adecuado
modelo para la inducción de tumores de LNH; así como también para lograr analizar el proceso de la angiogénesis
tumoral en LNH asociado a la sobreexpresión del VEGF.
Figura 7. A) Análisis por citometría de flujo en la línea celular Toledo sin permabilizar y B) permeabilizadas con Tween
empleando: control sólo células; control de isotipo y FITC-Fab(Bevacizumab).
21
Salud Militar 2017; 36(2):14-24
3.5. Estudios de biodistribución en ratones Balb/c
nude normales y portadores de LNH inducidos.
Los resultados de la caracterización farmacológica se
99m
muestran en la Tabla 2 Tc-HYNIC-Fab (Bevacizumab).
99m
Fue observada una elevada retención de Tc-HYNIC-
Fab(Bevacizumab) a nivel de los riñones, sugiriendo que
este radiotrazador posee un metabolismo renal. La
radioactividad en los riñones de ratones portadores de
tumores fue de 6.06 ± 20.97 %Act/g, 6.90±19.36 %Act/g
y 3.09 ± 5.79 %Act/g a 2, 6 y 24 h, respectivamente. En el
hígado, la absorción a los mismos tiempo fue 4.21 ± 0.33
%Act/g, 3.24 ± 0.95 y 3.85 ± 1.38 %Act/g,
respectivamente. Estos datos están acompañados por el
bajo porcentaje de dosis inyectada en el intestino y alto
porcentaje de dosis inyectada a nivel de la orina. A 2 h
99m
p.i., 68.78 ± 2.60 %Act de Tc-HYNIC-Fab(Beva-
cizumab) ha sido excretada en la orina y 4.16 ± 1.90
%Act detectada en los intestinos, en ratones portadores
de tumores (n=5). Los valores de la orina incluyen el
%Act a partir de la orina colectada y también la obtenida
en la vejiga.
Se observó a nivel tumoral una elevada retención de
99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab). A 2 h luego de la
inyección, la absorción a nivel tumoral fue de 2.44 ± 0.72
%Act/g seguido por 1.43 ± 0.49 %Act/g a 6 h y 4.90 ± 1.30
%Act/g a 24 h luego de su inyección. Además se
observaron relaciones tumor vs. músculo de 3.42, 5.13 y
7.88 a 2, 6 y 24 h, respectivamente.
Tabla 2. Estudios farmacocinéticos de 99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab) utilizando ratones
Balb/C normales y portadores de tumores LNH inducido a 2, 6 y 24 h p.i. Los valores fueron
expresados como %Act por gramo (o %Act) (media ± SD, n=5).
Ratones Balb/C normales Ratones Balb/C nude con tumor inducido
Tejidos 2 h 6 h 24 h 2 h 6 h 24 h
Porcentaje de dosis inyectada/gramo (%Act/g)*
Sangre 0.69±0.09 0.74±0.20 0.80±0.46 7.01±0.63 3.26±1.10 1.77±0.64
Hígado 1.35±0.03 0.91±0.14 0.75±0.21 4.21±0.33 3.24±0.95 3.85±1.38
Corazón 1.04±0.10 1.01±0.14 0.61±1.01 2.69±0.86 1.27±0.29 1.51±0.53
Pulmones 1.84±0.06 1.41±0.52 1.76±0.63 3.16±1.16 1.88±0.56 2.37±1.63
Bazo 0.75±0.13 0.47±0.25 1.31±0.23 3.44±0.30 2.47±0.65 1.11±0.71
Riñones 4.48±0.08 3.92±0.63 2.72±0.50 6.06±20.97 6.90±19.36 3.09±5.79
Tiroides 1.47±0.43 0.56±0.12 1.39±0.79 2.04±1.24 1.22±0.35 2.25±0.86
Músculo 1.06±0.52 1.10±0.31 0.40±0.68 0.71±0.09 0.28±0.07 0.62±0.58
Hueso 1.79±0.96 2.11±0.44 1.14±0.47 1.59±0.33 0.83±0.30 0.97±0.06
Estómago 1.19±0.26 0.84±0.18 0.70±0.46 2.73±0.79 4.87±3.00 1.09±0.07
TI 1.72±0.27 1.91±0.51 1.56±0.40 2.33±0.69 3.49±1.40 0.74±1.00
Tumor - - - 2.44±0.72 1.43±0.49 4.90±1.30
Porcentaje de dosis inyectada (%Act)*
Intestino 2.76±0.72 2.72±0.40 2.45±0.63 4.16±1.90 3.60±1.53 2.84±1.99
Orina 88.73±0.63 87.27±0.48 90.60±2.22 68.78±2.60 76.60±8.20 82.28±1.56
Uptake ratio of tumor/normal tissue*
Tumor/Sangre - - - 0.35 0.44 2.77
Tumor/Músculo - - - 3.42 5.13 7.88
* Datos presentados como %Act/g (o %Act) ± desviación estándar (DS) (n=5). TI=Tracto intestinal.
99mTc-HYNIC-Fab(Bevacizumab): potencial agente de imagen para diagnóstico de Linfoma No Hodgkin
Publicación de la DNSFFAA
22
4. DISCUSIÓN
El Bevacizumab es un AcMo capaz de unirse a los
factores VEGF; el cual es una de las principales
moléculas involucradas en la angiogénesis tumoral. Se
han encontrado que existen niveles elevados de VEGF
en LNH y que corresponden a un mal pronóstico. Debido
a que los fragmentos de unión al antígeno de los
anticuerpos monoclonales (fragmentos Fab) poseen
adecuadas características para estudios diagnóstico es
por ello que representan potenciales candidatos para
imagenología. De esta forma la marcación de los
99m
fragmentos Fab con un emisor gamma, como el Tc, se
podría emplear como método diagnóstico para evaluar
tanto la localización de la lesión como su extensión, así
como también para el seguimiento de pacientes con
LNH.
El objetivo del presente trabajo fue la marcación de los
99m
fragmentos Fab del Bevacizumab con Tc mediante el
agente bifuncional HYNIC con su posterior evaluación
radioquímica y biológica a través de diferentes ensayos.
Es muy importante en la marcación de moléculas blanco
con radionucleidos metálicos que retengan la actividad
biológica de la biomolécula. El grupo 6-hidrazinonicotinil,
conocido como HYNIC, es uno de los agente quelantes
bifuncionales más utilizados (25). La amplia mayoría de
los radiofármacos que están clínicamente disponibles en
99m
Medicina Nuclear son complejos de Tc debido a las
favorables características fisicoquímicas de este
99m
radionucleido. Además, el Tc es fácilmente disponible
99 99
y a bajos costos a partir de generadores de Mo- mTc.
Para llevar a cabo los estudios, primariamente se
procedió a realizar la fragmentación del AcMo Beva-
cizumab empleando la enzima papaína, con su posterior
purificación mediante el empleo de una columna de
proteína A. Se logró verificar mediante SDS al 10 % como
por HPLC la presencia de los Fab obtenidos de forma
pura, con un peso molecular aproximado de 50 kDa.
Posteriormente se realizó la derivatización con HYNIC
de los fragmentos Fab purificados y se controló la
conjugación mediante espectrometría de masa y HPLC,
confirmando la efectiva derivatización de los fragmentos
y que nos permitió estimar el número de moléculas de
BFC por Fab. Al evaluar los pesos moleculares, se
obtuvo una relación Fab (Bevacizumab):HYNIC de
aproximadamente 1:1. Estos resultados significan una
adecuada conjugación por parte del Fab al agente
quelante bifuncional HYNIC, lo que posibilitaría obtener
adecuadas actividades específicas.
Las marcaciones de los fragmentos conjugados con
99mTc se desarrollaron de forma rápida y sencilla,
presentado altas purezas radioquímicas, según se pudo
evaluar por distintos sistemas cromatográficos. Comple-
mentariamente los resultados obtenidos por HPLC
muestran un marcado estable que no parece afectar la
integridad del Fab y sin presencia de agregados
proteicos.
La estabilidad in-vitro del radiomarcado evaluada
mostraron altos niveles de pureza en todas las
condiciones estudiadas. El estudio realizado con el
agente de competencia L-Cisteína mostró una dismi-
nución de la estabilidad en un 17% a 4 h para
concentraciones de 1mM, mientras que a 0,1 mM se
observo un cambio de 7% de la PRQ. Estos resultados
son esperados dado que la L-Cisteína es un agente de
competencia que a concentraciones altas resulta un
99
competidor muy potente por el radionucleido mTc
formando complejos muy estables con el mismo.
Para comprobar la capacidad relativa de unión al VEGF
de los fragmentos Fab del Bevacizumab se realizó un
ensayo por citometría de flujo empleando una línea
celular humana de LNH (Toledo). En dicho estudio se
logró verificar la efectiva expresión y unión por parte de
los fragmentos Fab del Bevacizumab al VEGF
expresado por las células Toledo. Este ensayo nos
verificó que la inducción tumoral con dicha línea celular
podría ser un adecuado modelo para comprobar la
expresión de VEGF asociado a LNH. Posteriormente, se
realizaron estudios para determinar el perfil farmaco-
cinética del Fab(Bevacizumab) radiomarcado mediante
la realización de ensayos de biodistribución con ratones
Balb/C normales y portadores de tumores LNH inducido
a 2, 6 y 24 h. Se logró observar que posiblemente las
pequeñas diferencias significativas de la absorción de
99mTc-HYNIC-Fab (Bevcizumab) entre los ratones
normales y portadores de tumores inducidos en todos los
órganos analizados, podría deberse a la inducción
tumoral.
23
Salud Militar 2017; 36(2):14-24
Sin embargo, tanto en los ratones normales como
portadores de tumores, se observó una rápida depu-
ración sanguínea, con eliminación renal principalmente,
y ausencia de captación apreciable en otros órganos. La
eliminación renal, se sabe que es debido a productos de
metabolización de los Fab los cuales pueden ser filtrados
por el glomérulo renal unidos a radionucleido. Los datos
de la biodistribución de los ratones portadores de
tumores inducidos mostraron que a nivel tumoral poseen
99m
una elevada retención de Tc-HYNIC-Fab(Bevacizu-
mab). Dos horas luego de la inyección, la absorción a
nivel tumoral fue de 2.44 ± 0.72%Act/g seguido por 1.43
± 0.49%Act/g y 4.90 ± 1.30% Act/g a 6 y 24 h,
respectivamente. Además se observaron adecuadas
relaciones tumor vs músculo las cuáles nos permitirían
pensar en la realización de imágenes a partir de 2 h
posterior la inyección del compuesto marcado.
5. CONCLUSIONES
99 m
Fab(Bevaciuzmab) fue radiomarcado con Tc
empleando HYNIC como AQB obteniéndose adecuadas
99m
estabilidad, PQR y especificidad in-vitro e in-vivo. Tc-
HYNIC-Fab(Bevacizumab) representa un potencial a
agente de imagen de la expresión de VEGF asociada a
LNH.
Agradecimientos
Los autores quisieran agradecer a Laboratorios Roche®
por proporcionarnos el Bevacizumab (Avastin®). Este
trabajo fue apoyado por el Espacio Interdisciplinario de la
Universidad de la República (Uruguay) y la Agencia
Nacional de Investigación e Innovación (ANII, Uruguay).
No existen conflictos de intereses.
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