Salud Mil 2019; 38(1):33-45 33
ARTÍCULOS ORIGINALES
presencia de diferentes co-ligandos incluyendo Tri-
cina, Ácido etilendiaminodiacético, Tricina/Ácido eti-
lendiaminodiacético y Tricina/Ácido Nicotínico. Las
condiciones de marcación (pH, concentración de
co-ligandos, concentración de agente reductor (clo-
ruro de estaño), temperatura y tiempo de reacción)
fueron optimizadas en orden, para estandarizar el
procedimiento. Se evaluaron las purezas radioquí-
micas por HPLC. Tanto los coecientes de partición
(Log P) y la estabilidad in vitro fueron determinadas
a modo de obtener un agente de imagen estable y
de alta pureza radioquímica. Se realizaron estudios
biológicos in vitro e in vivo para evaluar; a modo de
obtener una aproximación al comportamiento bio-
lógico de los nuevos radiotrazadores. Logramos
radiomarcar los conjugados HYNIC-ATWLPPR y
HYNIC-GSG-ATWLPPR con 99m-Tecnecio, ob-
teniendo altas actividades especícas y purezas
radioquímicas, al emplear como co-ligandos tanto
Tricina como la mezcla Tricina/Ácido Nicotínico. Se
lograron obtener complejos estables y con baja lipo-
licidad (Log P de -3,21 ± 0,60 y -2,70 ± 0,28 para
RESUMEN
La Imagenología Molecular comprende la visualiza-
ción, caracterización y medida de procesos biológi-
cos a nivel molecular y celular en seres humanos
u otros seres vivos. Esta disciplina comprende la
realización de imágenes en 2 o 3 dimensiones y su
cuanticación en el tiempo. Las técnicas empleadas
incluyen, entre otras, a la medicina nuclear. Esto ha
llevado a la denición de agentes de imagen mo-
leculares, como sondas empleadas para visualizar,
caracterizar y medir procesos biológicos en siste-
mas vivos, siendo posible emplear moléculas endó-
genas y exógenas.
En el presente trabajo planteamos desarrollar y
optimizar la marcación con el radionucleido emisor
gamma, el 99m-Tecnecio, del heptapéptido an-
ti-angiogénico, el ATWLPPR, a modo de evaluar
su potencial empleo como agente de imagen mo-
lecular de los procesos angiogénicos asociados a
cáncer de mama.
Para esto, tanto HYNIC-ATWLPPR como HYNIC
-GSG-ATWLPPR fueron adquiridos comercialmen-
te. La marcación con
99m
Tc fue realizada a 50 ºC en
Potencial empleo del heptapéptido ATWLPPR como agente
de imagen molecular del angiogénesis tumoral
Potential use of the ATWLPPR heptapeptide as a molecular imaging
agent of tumor angiogenesis
(a) Departamento de Radiofarmacia. Centro de Investigaciones Nucleares. Facultad de Ciencias. Universidad
de la República. Montevideo. Uruguay.
(b) Centro de Medicina Nuclear. Hospital de Clínicas. Facultad de Medicina. Universidad de la República.
Montevideo. Uruguay.
Recibido para evaluación: Diciembre 2018
Aceptado para publicación: Abril 2019
Correspondencia: Mataojo 2055. C.P. 11400. Montevideo. Uruguay. Tel.: (+598) 25250901 int. 108. Fax: (+598) 25250895.
E-mail de contacto: xcdamata@gmail.com
Carolina Perroni
a
María Fernanda García
a
Juan Pablo Gambini
b
Marcelo Fernández
a
Pablo Cabral
a
http:// dx.doi.org/10.35954/SM2019.38.1.4
Ximena Camacho
a
https://orcid.org/0000-0002-0755-3834
https://orcid.org/0000-0002-6790-4851
https://orcid.org/0000-0002-2918-5761
https://orcid.org/0000-0001-5368-3464
https://orcid.org/0000-0002-5036-1459
https://orcid.org/0000-0001-7344-2027
34
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR y de -2,71 ± 0,12 y -2,97 ±
0,11 para
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR, emplean-
do Tricina y Tricina/Ácido Nicotínico, respectivamen-
te). El conjugado [
99m
Tc]-HYNIC-GSG-ATWLPPR/
Tricina/Ácido Nicotínico fue el que reveló la mayor
anidad de unión especíca por la Neuropilina-1 ex-
presados por la línea celular cáncer de mama aso-
ciado a un perl de biodistribución óptimo para ser
empleado como potencial agente de imagen diag-
nóstico del proceso angiogénico tumoral asociado
al cáncer de mama.
PALABRAS CLAVE: ATWLPPR, HYNIC; Imagenolo-
gía Molecular Oncológica; Neoplasias de la Mama;
Tecnecio Tc 99m Sestamibi.
ABSTRACT
Molecular Imaging comprises the visualization,
characterization and measurement of biological
processes at the molecular and cellular level in
humans or other living beings. This discipline includes
2 or 3 dimension imaging and their quantication
over time. Techniques used include, among others,
nuclear medicine. This has led to the denition
of molecular imaging agents, as probes used to
visualize, characterize and measure biological
processes in living systems, where endogenous and
exogenous molecules can be used.
In the present paper we propose to develop and
optimize the gamma emitting radionuclide labeling,
99m-Technetium, of the anti-angiogenic heptapep-
tide, the ATWLPPR, in order to assess its potential
use as a molecular imaging agent of the angiogenic
processes associated with breast cancer.
For this, both HYNIC-ATWLPPR and HYNIC-GSG-
ATWLPPR were commercially purchased. The 99mTc
labeling was performed at 50 °C in the presence of
dierent co-ligands including Tricine, Ethylenediamine
diacetic acid, Tricine/Ethylenediamine diacetic acid
and Tricine/Nicotinic acid. Labeling conditions (pH, co-
ligands concentration of reducing agent (tin chloride),
temperature and reaction time) were optimized in
order to standardize the procedure.
Radiochemical purities were assessed by HPLC.
Both the partition coecients (Log P) and in vitro
stability were determined in order to obtain a
stable imaging agent of high radiochemical purity.
Biological studies were carried out in vitro and in vivo
to assess; in order to obtain an approximation to the
biological behavior of the new radiotracers.
We were able to radiolabel the conjugates
HYNIC-ATWLPPR and HYNIC-GSG-ATWLPPR with
99m-Technetium, obtaining high specic activities
and radiochemical purities, using as co-ligands both
Tricine and the Tricine / Nicotinic Acid mixture. We
obtained stable complexes with low lipophilicity (Log
P of -3.21 ± 0.60 and -2.70 ± 0.28 for 99mTc-HYNIC-
ATWLPPR and -2.71 ± 0.12 and -2.97 ± 0.11 for
99mTc-HYNIC-GSG-ATWLPPR, using Tricine and
Tricine / Nicotinic Acid, respectively).
The conjugate [99mTc]-HYNIC-GSG-ATWLPPR /
Tricine / Nicotinic Acid was the one that revealed
the highest specic binding anity for Neuropilin-1
expressed by the breast cancer cell line associated
with an optimal biodistribution prole to be used as
potential diagnostic imaging agent of the angiogenic
tumor process associated with breast cancer.
KEY WORDS: ATWLPPR; HYNIC; Oncological Mo-
lecular Imaging; Breast Neoplasms; Technetium
Tc 99m Sestamibi.
INTRODUCCIÓN
La Imagenología Molecular (IM) comprende la visua-
lización, caracterización y cuanticación de procesos
biológicos a nivel molecular/celular en seres vivos
(1-4), combinando técnicas de imagen mínimamente
invasivas, con herramientas de biología molecular/
celular/medicina, etc. (2,5). Es un campo multidis-
ciplinario, dónde las imágenes producidas reejan
in-vivo procesos celulares, permitiendo comprender
diversas patologías para un mejor diagnóstico y/o
tratamiento (3). La IM juega un rol importante en la
evaluación del cáncer, ya que no solo permite visua-
lizar su localización, sino también permite visualizar
la expresión y actividad de moléculas especícas
(por ejemplo proteasas, protein kinasas) y procesos
Salud Mil 2019; 38(1):33-45 35
Potencial empleo del heptapéptido ATWLPPR como agente de imagen molecular del angiogénesis tumoral
biológicos (por ejemplo apoptosis, angiogénesis, me-
tástasis) que inuencian al tumor o su respuesta a
la terapia. Se espera que esta información tenga un
gran impacto en la detección del cáncer, planicación
de un tratamiento individualizado y en el desarrollo de
nuevas drogas; así como en nuestra comprensión de
los mecanismos subyacentes al origen del cáncer (6).
Cabe destacar que en nuestro país se registra un
perl de incidencia del cáncer similar al de países
desarrollados, siendo el cáncer de mama el de ma-
yor prevalencia en mujeres.
Debemos tomar en cuenta, que actualmente en cán-
cer de mama metastásico, no existe un tratamiento
para su cura. Un diagnóstico temprano seguido de
rápida remoción quirúrgica proporciona la mejor
oportunidad de sobrevida. La mamografía no es
capaz de detectar metástasis a distancia y por ello
técnicas como SPECT/CT y PET/CT son atractivas
para lograr una correcta estadicación de los pacien-
tes (7-11). Actualmente, el empleo de 18-FDG para
PET, no está indicado para el diagnóstico de cáncer
de mama primario (8-11). Sin embargo, a pesar de
que el
99m
Tc ([t ½ = 6,04 h, Eγ = 140 KeV (89%)] es
el radionucleido más empleado en medicina nuclear
por su bajo costo y fácil accesibilidad (12), no existen
trazadores especícos para cáncer de mama radio-
marcados con
99m
Tc. Su desarrollo permitiría que más
centros puedan contar los mismos, logrando realizar
una mejor estadicación de los pacientes y llevando
adelante una medicina personalizada.
La angiogénesis tumoral, denida como el desa-
rrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de los
pre-existentes, es esencial para el crecimiento y de-
sarrollo tumoral (13-17). Es controlado por factores
pro-/anti-angiogénicos (18), en especial el Factor de
Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF), que es ca-
paz de unirse a tres receptores (VEGFR-1/-2 y-3) y
a dos co-receptores, la Neuropilina-1 y -2 (NRP-1 y
-2) localizados en la supercie de las células endo-
teliales vasculares; conduciendo a la neovasculari-
zación del tejido neoplásico (13,17-20). La NRP-1,
es capaz de incrementar la unión VEGF/VEGFR-2
hasta 10 veces (15). Es capaz de promover la vas-
cularización de tumores prostáticos y es sobreex-
presada en otros tipos tumorales como cerebro,
mama, colon y pulmón (17,21-36).
El proceso angiogénico es un factor de mal pro-
nóstico (27) y por ello se han desarrollado di-
versos tratamientos anti-angiogénicos. El primer
inhibidor anti-angiogénico desarrollado fue el
TNP-470 (28) y actualmente existen más de 300
(29). Uno de estos inhibidores es el ATWLPPR,
cuyo blanco es la NRP-1 (30-33), representando
así un potencial candidato para la búsqueda de
nuevos agentes de imagen oncológicos que sean
especícos para la evaluación del proceso angio-
génico y progresión tumoral.
En el presente trabajo se pretende desarrollar un po-
tencial agente de imagen basado en la marcación del
ATWLPPR con
99m
Tc para diagnóstico del proceso
angiogénico tumoral asociado al cáncer de mama.
La química del marcado, con
99m
Tc de forma direc-
ta o a través de agentes quelantes bifuncionales
está bien establecida (34,35) y ha sido de amplio
uso en nuestro departamento, donde disponemos
de una plataforma ya establecida para la genera-
ción de este tipo de agentes de imagen (36-40).
Se sabe que la secuencia tetrapeptídica del extre-
mo C-terminal del ATWLPPR, –LPPR (-Leu-Pro-
Pro-Arg) posee un motivo estructural importante
para el reconocimiento del VEGF; donde ambos
residuos -Pro (Prolina) son responsables de la
determinación estructural, los de -Leu (Leucina) y
-Pro son esenciales para el reconocimiento y el de
-Arg (Arginina) es fundamental para su actividad
biológica. Por lo cual, los cuatro residuos -LPPR
son esenciales para la actividad del ATWLPPR
(30-33). Por lo tanto, la conjugación con el agente
quelante bifuncional se producirá a nivel del extre-
mo N-terminal o vía el linker GSG (Gly-Ser-Gly).
MATERIALES Y MÉTODOS
1- Síntesis de los péptidos HYNIC-ATWLPPR y
HYNIC-GSG-ATWLPPR
Los heptapéptidos HYNIC-ATWLPPR y HYNIC
-GSG-ATWLPPR fueron adquiridos en su forma
36
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
ya derivatizada con el agente quelante bifuncio-
nal Succidinimyl-hidrazinonicotinamida (HYNIC)
(agente quelante sintetizado en nuestro laborato-
rio por la Dra. María Fernanda García (40) con una
pureza > 95% (determinada por HPLC-UV). HYNIC
-ATWLPPR fue adquirido en forma liolizada con
una pureza del 97,3% y con un peso molecular 975
g/mol (mientras que el PM del ATWLPPR es próxima
a 840 g/mol) (gura 1 A), de la empresa Genscript
USA Inc. HYNIC-GSG-ATWLPPR fue adquirido en
su forma ya derivatizada con el agente quelante bi-
funcional HYNIC (gura 1 B) en forma liolizada con
una pureza del 95%; de la empresa Siquimia S.R.L.
2- Marcación del péptido con
99m
Tc
Se estudiaron distintas condiciones de marcación
con
99m
Tc empleando como co-ligandos los com-
puestos Tricina, ácido etilenodiamina-N-N’-diacéti-
co (EDDA), Tricina/EDDA y Tricina/Ácido Nicotínico
(AN), y como agente reductor el cloruro de estaño
(SnCl
2
). Todos los solventes empleados fueron pre-
viamente purgados con corriente de gas N
2
.
Las purezas radioquímica (PRQ) de todos los com-
plejos fueron analizados mediante el empleo de un
equipo Agilent Serie Innity 1200, equipado con un
detector GABI Star y utilizando una columna de fase
reversa C18 (250 mm x 4,6 x 10 µm, Restek Ultra),
el detector UV se estableció en 280 nm. El método
utilizado para la determinación de la PRQ fue el si-
guiente: gradiente de 20 min utilizando como fase
móvil Agua/Ácido Triuoroacético (TFA) 0,1% (A) y
Acetonitrilo (ACN)/TFA 0,1% (B), 0-5 min 0-45% B,
5-10 min 45-65% B, 10-20 min 100% B.
Para llevar a cabo las respectivas marcaciones se
utilizaron 20 µg tanto de HYNIC-ATWLPPR como
de HYNIC-GSG-ATWLPPR (1 µg/µL) almacenado
a -20 °C; a los cuales se les adicionaron:
• 150 µL de una solución de Tricina (100 mg/mL
en H
2
O destilada); 15 µL de una solución recién
preparada de SnCl
2
(1 mg/mL en 0.1 M HCl) y 185-
555 MBq de
99m
TcO
4
-
(hasta 500 µL). Se controla el
pH (4.5) y se incuba durante 30 min a 50 ºC en un
baño de agua termostatizado.
• 150 µL de una solución de Tricina (100 mg/mL en
H
2
O) y 100 µL Ácido Nicotínico (AN; 20 mg/mL en
H
2
O destilada); 5 µL de una solución de SnCl
2
re-
cién preparada (1 mg/mL en 0,1 M HCl) y 185-555
MBq de
99m
TcO
4
-
(hasta 500 µL). Se controla el pH
(5) y se incuba durante 30 min a 50 ºC en un baño
de agua termostatizado.
• 150 µL de una solución de Tricina (100 mg/mL
en H
2
O destilada) y 80 µL de EDDA (20 mg/mL en
H
2
O destilada); 15 µL de una solución de SnCl
2
recién preparada (1 mg/mL en 0,1 M HCl) y 185-
555 MBq de
99m
TcO
4
-
(hasta 500 µL). Se controla
el pH (5) y se incuba durante 30 min a 70 ºC en un
baño de agua termostatizado.
• 100 µL de EDDA (40 mg/mL en H
2
O destilada);
15 µL de una solución de SnC
l2
recién preparada
(1 mg/mL en 0,1 M HCl) y 185-555 MBq de
99m
TcO
4
-
(hasta 500 µL). Se controla el pH nal (5) y se in-
cuba durante 30 min a 70 ºC en un baño de agua
termostatizado.
3- Puricación de
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR y de
99m
Tc-HYNIC-GSG-LHRH
El control y puricación de los complejos pep-
tídicos marcados se realizaron mediante HPLC
utilizando el método que fue mencionado ante-
riormente. Posteriormente se diluyó la fracción
puricada con aproximadamente 500 µL de
PBS 0,1 M pH 7,4 y el ACN se redujo aplicando
Figura 1. Esquemas de los heptápéptidos HYNIC-
ATWLPPR (A) y HYNIC-GSG-ATWLPPR (B) sintetizados
por las empresas Genscript y Siquimia S.A. (Uruguay).
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una corriente de N
2
. Finalmente, se controla pH
y si es necesario se añade PBS 0,1 M pH 7,4.
4- Coeciente de reparto o Log P
Para evaluar los valores de Log P, se puricaron
por HPLC los conjugados de HYNIC-ATWLPPR y
HYNIC-GSG-ATWLPPR/coligando marcados con
99m
Tc. El disolvente fue eliminado y el los conju-
gados marcados (0,74 MBq) fueron reconstituidos
en PBS (pH 7,4, 0,1 M, 20 mL).
Tubos conteniendo 500 µL de Octanol y 500 µL
de los conjugados marcados disueltos en PBS,
fueron vigorosamente agitados durante 1 min y
centrifugados a 14.000 rpm durante 10 min. Seis
fracciones de 100 µL fueron colectadas de ambas
fases, para la medición de sus respectivas cuen-
tas en un contador de pozo de NaI. El coeciente
de reparto se obtuvo como el log (cuentas por min
en octanol / cuentas en fase acuosa).
5- Estabilidad in vitro
5.1- Estabilidad en PBS
Se estudió la estabilidad in vitro de todos los
conjugados marcados
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/
Tricina,
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina,
99m
Tc
-HYNIC-ATWLPPR/Tricina/AN,
99m
Tc-HYNIC-
GSG -ATWLPPR/Tricina/AN, HYNIC-ATWLPPR/
Tricina/AN,
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina/
AN,
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/Tricina-EDDA,
99m
Tc
-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina-EDDA, HYNIC-
ATWLPPR/Tricina/AN,
99m
Tc-HYNIC-GSG-
ATWLPPR/Tricina/AN,
99m
Tc-HYNIC- ATWLPPR/
EDDA y
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/EDDA.
Para evaluar la estabilidad, se puricaron por HPLC
todos los conjugados radiomarcados por el método
previamente descripto. Se incubó una alícuota de
1,85 MBq de cada complejo en 500 µL de PBS a
37 ºC hasta 4 hs. Cada experimento fue realizado
por triplicado y controlado por HPLC.
5.2- Estabilidad en Suero Fetal Bovino (SFB)
Se estudió la estabilidad in vitro de los conjugados
marcados empleando los distintos co-ligandos incu-
bando una alícuota de cada complejo peptídico en
SFB a 37 ºC, hasta 4 h. Las proteínas fueron preci-
pitadas ACN y centrifugadas (1750 g, 5 min, 4 ºC).
Se midió la actividad del precipitado y del sobrena-
dante en un contador de pozo de NaI. Finalmente,
el sobrenadante fue analizado por RP-HPLC para
evaluar la estabilidad de los complejos de
99m
Tc.
5.2- Estabilidad en L-Cisteína.
Se estudió la estabilidad in vitro de los conjugados
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/Tricina,
99m
Tc-HYNIC-GSG
-ATWLPPR/Tricina,
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/Tricina/
AN y
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina/AN en
L-Cisteína mediante el método previamente des-
cripto por Hnatowich et al. (41). Para ello fueron in-
cubados alícuotas de cada complejo radiomarcado
disueltos en 500 µL de PBS en distintas concentra-
ciones de L-Cisteína (0,1 y 1,0 mM) a 37 ºC, hasta
4 hs. Todos los estudios fueron realizados por tripli-
cado y analizadas sus respectivas PRQ fueron eva-
luados por RP-HPLC.
6- Modelos celulares
Las líneas celulares humanas de cáncer de mama
MDA-MB-231 y de broblastos normales NIH3T3,
fueron adquiridas de American Type Culture Collec-
tion (ATCC). El medio base utilizado para la línea
celular MDA-MB-231 fue RPMI-1640 (Capricorn),
suplementado con SFB a una concentración nal
de 10 %, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL penicilina
y 100 µg/mL streptomicina; mientras el medio base
utilizado para la línea celular NIH3T3 fue DMEM alta
glucosa (Capricorn), suplementada con SFB a una
concentración nal de 10%, 100 U/mL penicilina y
100 µg/mL streptomicina y 100 µg/mL de HEPES.
Los cultivos fueron incubados a 37 °C con 5% de
CO
2
y una atmósfera del 95% de humedad.
7- Estudios biológicos in vitro de unión celular
Se realizaron ensayos de anidad de unión especí-
ca en las líneas celulares mencionadas. Las células
fueron cultivadas en medio de cultivo durante dos
semanas. Se determinó el número de células y se
incubaron 10
6
células en 1,0 ml de medio de cultivo
con ~100 nM de
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/Tricina/
Potencial empleo del heptapéptido ATWLPPR como agente de imagen molecular del angiogénesis tumoral
38
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
AN y
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina/AN por
30, 60 y 120 min a 37 ºC.
La respectiva unión a la membrana fue determinada
mediante un lavado (300 uL) con acetato de sodio
(40 mM, pH 4,5) y la internalización fue determinada
mediante un segundo lavado (300 uL) de NaOH 1N
por 10 min. La cuanticación de las respectivas cuen-
tas por min (CPM) de los péptidos radiomarcados en
cada lavado fue determinado mediante el empleo de
un contador gamma automático (Capintec CRC-7,
Montvale, N.J., EE.UU.). Cada punto se realiza por
cuadruplicado.
Con el n de conrmar el grado de unión no es-
pecíca, se llevaron a cabo un ensayo en para-
lelo incubando las células durante 2 h con 10 μg
de los péptidos sin marcar (HYNIC-ATWLPPR y
HYNIC-GSG-ATWLPPR) y posteriormente se rea-
lizaron las mismas condiciones experimentales an-
teriormente mencionadas.
8- Estudios de estabilidad biológicos in vivo
La evaluación biológica in vivo de los complejos
99m
Tc-
HYNIC-ATWLPPR/Tricina/AN y
99m
Tc-HYNIC -GSG-
ATWLPPR/Tricina/AN se llevaron a cabo mediante la
realización de estudios de biodistribución. Todos los
procedimientos con animales fueron aprobados por
la Comisión Honoraria de Experimentación Animal
(Protocolo Nº: 240011-001280-16). Los ensayos
fueron realizados en ratones normales BALB/c,
entre 6-10 semanas de edad y 18-24 g. Animales
(n=5 por grupo) fueron inyectados por la vena de la
cola con aproximadamente 1-3 MBq del complejo
de los complejos radiomarcados y sacricados por
dislocación cervical luego de 1 y 2 h. Los tejidos
seleccionados (corazón, hígado, pulmones, tiroides,
riñones, estómago, bazo, tracto gastrointestinal y
vejiga) fueron extirpados, enjuagados de la sangre
residual, pesados y sus respectivas radiactividades
medidas en un detector NaI(Tl). La sangre y orina
fueron también colectados y medidos. La radioactividad
en todos los tejidos es expresada como porcentaje de
dosis inyectada (% DI) y como porcentaje de dosis
inyectada por gramo de tejido (% DI/g).
Los resultados se expresaron como media ± error
estándar. El análisis estadístico se realizó mediante
la prueba no apareada t. Fue considerado signica-
tivo un valor de p ≤ 0,05.
RESULTADOS
1- Marcación con
99m
Tc de HYNIC-ATWLPPR y
HYNIC-GSG-ATWLPPR
Primariamente se evaluó por HPLC el perl de los
péptidos sin marcar mediante el empleo del detector
UV en las condiciones mencionadas anteriormente,
revelando Tiempos de Retención (Tr) de 7,35 y 7,45
min para HYNIC-ATWLPPR (gura 2 A) y HYNIC
-GSG-ATWLPPR (gura 2 B).
Posteriormente, se evaluó por HPLC el perl del
99m
TcO
4
-
en las condiciones ensayadas, revelando
un Tr de 3,63 min; de lograr establecer su posible
presencia en los distintos conjugados como impure-
za radioquímica (gura 3).
Los conjugados HYNIC-ATWLPPR y HYNIC-GSG
Figura 2. Perl RT-HPLC de los péptidos HYNIC-ATWLPPR (A) y HYNIC-GSG-ATWLPPR (B) empleando detector UV
a 280 nm. Tiempo retención (Tr): 7,35 min y 7,45 min, respectivamente.
Salud Mil 2019; 38(1):33-45 39
Figura 3. Perl de RT-HPLC de
99m
TcO
4
-
. Tr: 3,63 min.
Figura 4. Perl de RT-HPLC del
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/Tricina (A) y
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina (B) en
columna C18. Tr: 7,20 min y 7,37 min, respectivamente.
Figura 5. Perl de RT-HPLC del
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/Tricina/AN (A) y
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina/AN
(B) en columna C18. Tr: 7,38 min y 7,23 min, respectivamente.
-ATWLPPR se lograron marcar con rendimientos
superiores a 97,6 ± 3,2% y 99,5 ± 2,25%, respectiva-
mente, empleando Tricina como co-ligando a 50 °C
durante 20 min. Ambos complejos se lograron puri-
car exitosamente a través de HPLC, con Tr de 7,2 y
7,37 min (gura 4 A y B).
Empleando la mezcla de co-ligandos Tricina/AN se
obtuvieron rendimientos de marcación de 96,89 ±
2,50% y 98,52 ± 2,51% para HYNIC-ATWLPPR y
HYNIC-GSG-ATWLPPR, respectivamente. Presen-
tando Tr de 7,38 y 7,23 min (gura 5 A y B).
Empleando la mezcla de co-ligandos Tricina/EDDA
se obtuvieron rendimientos de marcación de 84,52
± 4,19% y 92,68 ± 5,48% para HYNIC-ATWLPPR y
HYNIC-GSG-ATWLPPR, respectivamente. Presen-
tando Tr de 7,15 y 7,02 min (gura 6 A y B).
Por último, empleando la mezcla el co-ligando EDDA
se obtuvieron rendimientos de marcación de 31,93
± 4,19% y 85,51 ± 2,41% para HYNIC-ATWLPPR
y HYNIC-GSG-ATWLPPR, respectivamente. Pre-
sentando Tr de 7,40 (gura no mostrada) y 7,23 min
(gura 7).
2- Coecientes de Reparto o log P
Se evaluó el carácter hidrofílico de los complejos
peptídicos marcados con
99m
Tc utilizando los distin-
tos co-ligandos, mediante el cálculo del coeciente
de reparto octanol-agua. Los valores obtenidos se
muestran en la gura 8. En todos los casos el com-
plejo estudiado mostró ser hidrofílico.
Potencial empleo del heptapéptido ATWLPPR como agente de imagen molecular del angiogénesis tumoral
40
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
3- Estabilidad in vitro
Se estudió la estabilidad in vitro en PBS de los radio-
conjugados hasta 4 hs. (gura 9 A y B).
Todos los radiocomplejos resultaron estables, pero
sólo los complejos marcados con los co-ligandos
Tricina y Tricina/AN presentaron purezas radioquí-
micas mayores al 90% hasta las 4 hs. del ensayo.
4- Estabilidad en SFB
También la estabilidad de los radiocomplejos se
analizó en SFB hasta 4 hs. (gura 10 A y B). Se
observó que al marcar los complejos empleando
el co-ligando Tricina y la mezcla de co-ligando Tri-
cina/AN, presentaron una menor unión a proteínas
plasmáticas. En especial al emplear la mezcla de
Figura 6. Perl de RT-HPLC del
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/Tricina/EDDA (A) y
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina/
EDDA (B) en columna C18. Tr: 7,15 min y 7,02 min, respectivamente.
Figura 7. Perl de RT-HPLC del
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/EDDA en columna C18. Tr: 7,23 min.
Figura 8. Estudio del coeciente de reparto (Log P) de
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/co-ligandos y
99m
Tc-HYNIC-GSG-
ATWLPPR/co-ligandos.
Log P para
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/Tricina; EDDA; Tricina/
EDDA y Tricina/ AN como co-ligandos
Log P
Tricina EDDA Tricina/EDDA Tricina/AN
-3.21 ± 0.60 -1.35 ± 0.30 -2.35 ± 0.15 -2.70 ± 0.28
Log P para
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina; EDDA; Tricina/
EDDA y Tricina/AN como co-ligandos
Log P
Tricina EDDA Tricina/EDDA Tricina/AN
-2.71 ± 0.12 -1,59 ± 0.17 -2,77 ± 0.08 -2.97 ± 0.11
co-ligandos Tricina/AN se observó la menor unión.
5- Estabilidad en L-Cisteína
Por último, la estabilidad de los conjugados mar-
cados se evaluó mediante un estudio de transque-
lación en distintas concentraciones de L-Cisteína
(guras 11 y 12). Se realizó únicamente con los
complejos marcado con el co-ligando Tricina y la
mezcla de co-ligandos Tricina/AN, debido a que fue-
ron los que presentaron mayor estabilidad tanto en
PBS como en SFB.
Se observó que el complejo
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR
empleando la mezcla de co-ligandos Tricina/AN a 1
h de incubación presentó la mayor estabilidad, con
PRQ de 99,85 ± 0,30% y 98,50 ± 1,85% en 0,1 mM
y 1,0 mM de L Cisteína, respectivamente. Mientras
que, a 4 hs. de incubación, se observaron señales de
degradación cercanas a 2 y 5% en 0,1 mM y 1,0 mM
de L Cisteína, respectivamente (gura 11).
Mientras que para el complejo
99m
Tc-HYNIC-GSG-
ATWLPPR empleando la mezcla de co-ligandos Tri-
cina/AN se observó que a 1 h de incubación también
reveló la mayor estabilidad, con PRQ de 100,00 ±
0,50% y 99,16 ± 0,84% en 0,1 mM y 1,0 mM de
L-Cisteína, respectivamente. Pero a 4 hs. de incu-
bación, se observaron señales de degradación úni-
Salud Mil 2019; 38(1):33-45 41
camente del 1% a 0,1 mM y 1,0 mM de L-Cisteína,
respectivamente (gura 12).
El análisis de la estabilidad en L-Cisteína demostra-
ron que ambos complejos radiomarcados emplean-
do la mezcla de co-ligandos Tricina/AN presentaron
las mayores PRQ y estabilidades. Es por lo anterior,
Figura 9. Estudios de estabilidad in vitro en PBS de
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR (A) y
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWL-
PPR (B). (% PRQ: % Pureza radioquímica).
Figura 10. Estudios de estabilidad in vitro en SFB de
99m
Tc-
HYNIC-ATWLPPR (A) y
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR (B).
Figura 11. Estudio de estabilidad in vitro del complejo
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR en distintas concentraciones
de L-Cisteína empleando Tricina y la mezcla de co-li-
gandos Tricina/AN.
Figura 12. Estudio de estabilidad in vitro del complejo
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR en distintas concentra-
ciones de L-Cisteína empleando Tricina y la mezcla de
co-ligandos Tricina/AN.
% PRQ Tricina Tricina/AN
Tiempo
(H)
1 2 4 1 2 4
L-Cisteína
0.1 mM
96.25
±0.36
94.25
±0.75
90.28
±1.05
99.85
±0.30
99.60
±1.25
98.55
±1.20
L-Cisteína
1.0 mM
93.45
±1.25
90.18
±0.22
88.47
±0.75
98.50
±1.85
97.20
±1.25
94.80
±2.15
% PRQ Tricina Tricina/AN
Tiempo
(H)
1 2 4 1 2 4
L-Cisteína
0.1 mM
98.10
±1.24
97.52
±1.68
96.86
±0.74
100.00
±0.50
100.00
±2.85
99.71
±2.30
L-Cisteína
1.0 mM
97.27
±0.85
96.18
±1.42
93.47
±0.85
99.16
±0.84
99.05
±2.30
98.98
±1.65
que tanto para los ensayos biológicos in vitro como in
vivo, para evaluar los péptidos radiomarcados serán
analizados empleando dicha mezcla de co-ligandos.
6- Estudios biológicos in vitro de unión celular
Para evaluar la anidad de unión especíca de los
complejos peptídicos radiomarcados al NRP-1, se
realizaron estudios in vitro de unión y de bloqueo
mediante la incubación de los respectivos comple-
jos en la línea MDA-MB-231 (cáncer de mama hu-
mana). La línea celular NIH3T3 fue empleada como
control negativo de unión celular.
En la línea celular MDA-MB-231, empleando
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR la unión fue de 3,25 ±
0,64%, 5,77 ± 0,31% y 8,09 ± 0,42%; mientras
que al emplear
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR
la unión fue de 15,42 ± 4,04%, 17,82 ± 0,84% y
21,41 ± 1,97% a los 30, 60 y 120 min respectiva-
mente. A su vez, se observó que al emplear 20 µg
de HYNIC-ATWLPPR sin marcar previamente a
la adhisión de
99m
Tc-HYNIC- ATWLPPR, presentó
Potencial empleo del heptapéptido ATWLPPR como agente de imagen molecular del angiogénesis tumoral
42
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
una inhibición del 45,85%, 73,66 y 76,76% a los
30, 60 y 120 min respectivamente (gura 13 A);
mientras que al emplear HYNIC-GSG-ATWLPPR
se observó una inhibición de la adhisión de
99m
Tc-
HYNIC-GSG-ATWLPPR de 46,30%, 48,05% y
42,55% (gura 13 B).
En la línea celular empleada como control, la
NIH-3T3, se observó una unión despreciable de
los complejos radiomarcados (gura 13 A y B).
Los estudios de unión in vitro llevados a cabo en
la línea celular MDA-MB-231 revelaron la efectiva
unión de los complejos radiomarcados a la NRP-1
expresada por dicha línea celular.
7- Estabilidad biológica in vivo: estudios de bio-
distribución
La evaluación biológica in vivo de los complejos
99m
Tc-
HYNIC-ATWLPPR/Tricina/AN y
99m
Tc-HYNIC-GSG-
ATWLPPR/Tricina/AN se llevó a cabo mediante la
realización de estudios de biodistribución en ratones
Balb/C normales. Las biodistribuciones fueron
realizadas luego de 1 y 2 hs. (n = 4) (gura 14). La
eliminación de ambos complejos peptídicos resultó
ser muy rápida, observándose en vejiga un 17,58 ±
5,29% Act y 63,20 ± 8,79% Act a 1 y 2 hs. para
99m
Tc-
HYNIC-ATWLPR/Tricina/AN y 68,68 ± 5,81% Act y
78,36 ± 4,95% Act a 1 y 2 hs. para
99m
Tc- HYNIC-
GSG-ATWLPR/Tricina/AN, respectivamente. A su
vez se observó una retención inespecíca a nivel
renal de ambos complejos. La captación en el resto
de órganos normales fue < de 2% Act/g.
DISCUSIÓN
Mediante el presente trabajo logramos realizar el es-
tudio preliminar del heptapéptido ATWLPPR como
potencial agente imagen diagnóstico de los proce-
sos angiogénicos asociados a cáncer de mama.
Para poder hallar el mejor complejo peptídico para
el radiomarcado se evaluó la posibilidad de unir al
agente quelante bifuncional de dos formas distin-
tas: la primera, se unió de forma directa el extremo
N-terminal del heptapéptido al HYNIC y la segunda,
mediante la modicación empleando un linker; el tri-
péptido, Gly-Ser-Gly (GSG) y posterior conjugación
Figura 13. Porcentaje de unión a membrana y bloqueo
en las líneas celulares MDA-MB-231 y NIH-3T3 para
el complejo
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/Tricina/AN (A) y
para
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina/AN (B).
Figura 14. Estudio de biodistribución en ratones Balb/C
normales a 1 y 2 p.i. de
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/Tricina/
AN y
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina/AN. % Acti-
vidad/gramo (% Act/g) (n=4, % Act/g ± DS); % Actividad
(% Act) (n=4, % Act ± DS).
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/
Tricina/AN
99m
Tc-HYNIC- GSG-
ATWLPPR/Tricina/AN
Tejidos
1 h 2 h 1 h 2 h
% Act/g
Sangre
2.45 ± 1.29 2.18 ± 1.10 2.18 ± 0.96 0.34 ± 0.11
Hígado
1.51 ± 0.71 1.03 ± 0.48 0.85 ± 0.19 0.36 ± 0.13
Corazón
1.97 ± 1.61 0.79 ± 0.47 1.55 ± 0.95 0.89 ± 0.34
Pulmón
1.98 ± 0.89 1.35 ± 1.21 1.07 ± 0.23 0.56 ± 0.11
Bazo
0.97 ± 0.57 0.43 ± 0.16 1.92 ± 0.66 0.48± 0.24
Riñones
21.02 ± 5.29 6.36 ± 4.22 8.02 ± 0.99 2.97 ± 0.14
Tiroides
1.48 ± 1.16 0.68 ± 0.08 1.73 ± 0.23 1.56 ± 0.12
Músculo
0.50 ± 0.28 0.26 ± 0.06 0.51 ± 0.03 0.46 ± 0.36
Hueso
0.62 ± 0.25 0.29 ± 0.13 1.31 ± 0.82 0.70 ± 0.06
Estómago
1.09 ± 0.32 0.49 ± 0.34 1.92 ± 0.57 2.34 ± 0.16
Intestino
1.96 ± 0.83 1.20 ± 0.23 1.51 ± 0.36 3.91 ± 0.49
% Act
Intestino
3.61 ± 1.77 2.28 ± 0.62 2.41± 0.67 4.38 ± 2.97
Orina
17.58± 5.29 63.20± 8.79 68.68± 5.81 78.36± 4.95
Salud Mil 2019; 38(1):33-45 43
con el agente bifuncional HYNIC. Mediante ambas
formas se logró radiomarcar ambos conjugados de
manera óptima con el radionucleido
99m
Tc.
Según el empleo del co-ligando se lograron variadas
actividades especícas, todas superiores al 80%,
excepto al emplear el co-ligando EDDA al radio-
marcar el complejo
99m
Tc-HYNIC-ATWLPPR/EDDA.
Como evaluación pre-clínica, realizamos estudios in
vitro de estabilidad, unión a proteínas y lipolicidad
a modo de predecir la posible biodistribución en el
organismo.
El estudio de pureza radioquímica de todos los con-
jugados y su subsiguiente puricación por HPLC
permitió detectar la presencia de los conjugados
marcados con
99m
Tc de forma eciente. Las mayores
purezas radioquímicas se lograron al utilizar los co-li-
gando Tricina y Tricina/AN; estos también mostra-
ron ser los más hidrofílicos (menor Log P) y los que
presentan mayor estabilidad, tanto en PBS como en
SFB 37 ºC hasta 4 hs.; por lo cual evaluamos la es-
tabilidad de estos complejos hasta 4 hs. con distintas
concentraciones de L-Cisteína, logrando adecuados
rendimientos en especial al emplear el conjugado
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina/AN, debido a
esto fue el seleccionado para llevar a cabo los estu-
dios biológicos in vitro e in vivo.
Los estudios biológicos in vitro en la línea celular
de cáncer de mama, así como en la línea celular
NIH-3T3 de broblastos normales (control negati-
vo) se realizaron para evaluar la anidad de unión
del conjugado
99m
TcHYNIC-GSG-ATWLPPR/Tri-
cina/AN a la NRP-1. Se observó que el complejo
radiomarcado presentó una signicativa unión en
la línea de cáncer de mama evaluada (15-20%) en
comparación con la línea control (< 0,5%).
Se observó a su vez una inhibición > 40% al em-
plear el péptido sin marcar, lo que indica la especi-
cidad de la unión del radioconjugado a la NRP-1
expresado por la línea celular ensayada.
Por último se vericó la efectiva estabilidad obser-
vada del conjugado
99m
TcHYNIC-GSG-ATWLPPR/
Tricina/AN mediante estudios de biodistribución en
ratones Balb/C normales, revelando un perl de bio-
distribución muy adecuado para el desarrollo de un
agente de imagen diagnóstico, con elevada elimina-
ción renal y baja retención inespecíca a nivel renal
(más del 60% las 1 h p.i.), la cual nos alentaría a
realizar futuras imágenes moleculares en modelos
murinos portadores de tumores de mama inducidos.
CONCLUSIONES
Mediante el presente estudio logramos llevar a cabo
la optimización de la marcación con
99m
Tc de los con-
jugados HYNIC-ATWLPPR y HYNIC-GSG-ATWL-
PPR de forma fácil, rápida y sencilla. Se encontró
que el complejo
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tri-
cina/AN presenta la > PRQ y estabilidad en todos
los ensayos realizados, no requiriendo una posterior
puricación.
99m
Tc-HYNIC-GSG-ATWLPPR/Tricina/
AN reveló una adecuada anidad de unión por su
receptor en modelos in vitro de cáncer de mama,
como también se observaron perles de eliminación
ideales, representando de esta forma un promete-
dor agente de imagen molecular para el diagnóstico
de la expresión de la NRP-1 oncológico. A futuro
pretendemos realizar estudios imagenológicos en
modelos tumorales de cáncer de mama.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Agencia Nacional de Investiga-
ción e Innovación (ANII, Uruguay), a la Comisión
Sectorial de Investigación Cientíca (CSIC) y a los
programas ProInBio-Medicina y PEDECIBA-Quí-
mica. No existen conictos de intereses.
Potencial empleo del heptapéptido ATWLPPR como agente de imagen molecular del angiogénesis tumoral
44
Publicación de la D.N.S.FF.AA.
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