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99mTc-Tocilizumab un nuevo agente de imagen
molecular en Mieloma Múltiple
ARTÍCULO ORIGINAL
E. Gutiérrez a, X.Camacho a, V. Calzada a, M. Fernández a, M.F. García a,
W. Porcal c, N. Oddone d, M. Moreno e, J. Benech d, J A. Chabalgoity e, A. Pandiellaf, E.
Riva b, P. Cabral a.
a) Departamento de Radiofarmacia, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
b) Clínica Hematológica, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina, Montevideo, Uruguay.
c) Grupo de Química Medicinal, Laboratorio de Química Orgánica, Facultad de Ciencias-Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
d) Señalización celular y nanobiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Montevideo, Uruguay
e) Biotecnología, Instituto de Higiene, Facultad de Medicina, Montevideo, Uruguay.
f) Centro de Investigación del Cáncer-Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer, CSIC-USAL, Salamanca, España.
Resumen
La interleucina 6 (IL-6) es una molécula clave en la patogénesis del Mieloma Múltiple (MM). La sobre-expresión de su receptor,
IL6R, en las células de MM se puede utilizar como blanco para el desarrollo de potenciales agentes moleculares para su diag-
nóstico. El Tocilizumab (Actemra®) es un anticuerpo monoclonal contra IL6R.
El objetivo de este trabajo es el desarrollo y evaluación, a través de distintos métodos químicos y biológicos, la marcación de
99mTc-Tocilizumab utilizando dos agente quelantes, Succidinimyl-hidrazinonicotinamida (HYNIC) y tricarbonilo.
En primer lugar se derivatizó el Tocilizumab (Roche) con HYNIC y se marcó utilizando 99mTc/tricina/Sn2Cl a temperatura ambiente.
La marcación del anticuerpo con [99mTc(CO)3(OH2)3]+ se llevó a cabo incubando 45 min a 37ºC. La pureza radioquímica (PQR)
fue evaluada por ITLC-SG y HPLC. Se realizaron estudios in-vitro de unión y competencia con células de MM U266 hasta 120
minutos. Se obtuvieron imágenes uorescentes y por microscopía de fuerza atómica de las células U266. Se realizaron estudios
in-vivo en ratones CD1 normales (n=3).
Se observó una PRQ mayor a 90% con ambos quelantes utilizados, siendo estable y sin mostrar transquelación signicativa al
menos durante 24 hs. La microscopía confocal mostró la capacidad del Tocilizumab-FITC para reconocer IL6R en las células
U266. Los experimentos in-vitro de unión y desplazamiento conrman la especicidad de reconocimiento del 99mTc-Tocilizumab
por IL6R. Los estudios de biodistribución mostraron absorción hepática y eliminación renal principalmente.
De los resultados obtenidos se concluyó que ambos marcados del Tocilizumab con 99mTco4-, vía HYNIC y vía tricarbonilo, podrían
ser potenciales agentes de imagen para el diagnóstico de Mieloma Múltiple.
Palabras claves: MIELOMA MÚLTIPLE
TOCILIZUMAB; IL-6 RECL; IL-6 FAMILY CYTOKINE
TRICARBONILO
HYNIC
INTRODUCCIÓN
El Mieloma Múltiple (MM) es una neoplasia de la línea
linfoide B que se caracteriza por la proliferación clonal
de células plasmáticas malignas en la médula ósea y
se asocia con presencia de componente monoclonal
o proteína M en sangre y/o suero (1). Representa la
segunda neoplasia hematológica en frecuencia, el 10%
de todas las neoplasias malignas hematológicas en los
caucásicos y el 20% en los afroamericanos (2,3), el 1%
de los tumores malignos.
Una de las principales moléculas involucradas en la
patogenia del MM es la interleucina 6 (IL-6). Esta es
un polipéptido perteneciente a la clase de las citocinas
helicoidales, secretada por un amplio rango de células.
Recibido: Junio 2012
Aceptado: Agosto 2012
https://doi.org/10.35954/SM2012.31.1.2
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Posee actividad antiinamatoria y proinamatoria,
además es capaz de estimular la producción
hiposaria de ACTH. Interviene en la producción de
inmunoglobulinas, en la diferenciación de linfocitos B,
activa linfocitos T citotóxicos, las células plasmáticas,
modula la hematopoyesis y es la responsable junto
con la IL-1, de la síntesis de proteínas de fase aguda
en el hígado, siendo uno de los mediadores más
importantes de la ebre y de la respuesta de fase
aguda (4-6). La desregulación de su producción causa
diferentes situaciones patológicas, como enfermedades
autoinmunes, inamatorias, y linfoproliferativas. Se ha
demostrado que la IL-6 está implicada en enfermedades
tales como artritis reumatoide (RA), enfermedad de
Castleman, artritis idiopática juvenil (AIJ), y enfermedad
de Crohn (7). La IL-6 también se ha identicado como
un factor crucial para el crecimiento, supervivencia y
proliferación de las células de MM, tanto in-vivo como
in-vitro. (4,8,9)
Se sabe que los anticuerpos anti-IL6 bloquean el
crecimiento in-vitro de células en plasma y la proliferación
tumoral, en líneas celulares de mieloma y en pacientes
tratados con estos anticuerpos (10). El Tocilizumab
(TCZ) es un anticuerpo monoclonal humanizado de
la clase de IgG1, producido por tecnología del ADN
recombinante. Esta dirigido contra el receptor tanto
soluble (IL-6s), como de membrana (IL-6m), de la IL-6
bloqueando la señalización mediada por estos (11-13).
Actualmente al menos el 80% de los radiofármacos
utilizados en Medicina Nuclear para diagnóstico son
compuestos marcados con Tecnecio 99 metaestable
(99mTc). Su elección para su uso en Medicina se basa
en las características sicoquímicas del mismo, como
su tiempo de vida media (T1/2) de 6.04 hs, su modo
de decaimiento por transición isomérica y una emisión
de radiación gamma de 140 keV de energías (14). El
mismo es fácilmente obtenido a partir de generadores
99Mo-99mTc en una forma estéril, apirógeno y libre de
portador (9,10).
Existen varias estrategias de marcación de péptidos
y proteínas con 99mTc. Para el desarrollo de este
trabajo se realizará la marcado a través de distintos
agentes quelantes bifuncionales (BFC), utilizando
el Succidinimyl-hidrazinonicotinamida (HYNIC) y el
compuesto organometálico [(CO)3(H2O)3]+ (CO3).
El HYNIC se ha empleado para el marcado de Ac
monoclonales con 99mTc así como para de proteínas,
pequeñas biomoléculas, liposomas y péptidos. Entre
las ventajas de utilizarlo como BFC se encuentra su alta
eciencia de marcado y las altas actividades especícas
obtenidas. Debido a que el HYNIC sólo ocupa uno de
los dos sitios de coordinación, es necesario para la total
complejación del Tc, utilizar un coligando como la tricina.
La conjugación se produce entre el HYNIC y el grupo
amino épsilon de los residuos de lisina de las proteínas,
dando así un conjugado HYNIC-proteína. Finalmente se
obtiene un conjugado coordinado por dos moléculas de
Tricina y por el átomo N-terminal del grupo hidracina del
HYNIC que posteriormente es marcado con 99mTc. (14-
17)
Por otro lado la síntesis de rutina de compuestos
organometálicos acuosos de iones [99mTc(CO)3(H2O)3]+,
se realiza directamente a partir de [99mTcO4]- en solución
de NaCl 0,9% bajo atmósfera de CO. La posterior
sustitución de los ligandos lábiles de agua por un ligando
bifuncional conectable a las biomoléculas permite la
introducción del complejo carbonilíco. Se ha visto que
utilizando este ligando se obtiene altas actividades
especícas y complejos muy estables (18,19).
El objetivo del presente trabajo es el desarrollo de la
marcación y evaluación radioquímica y biológica del
Tocilizumab con 99mTc. La posibilidad de marcar el
TCZ con 99mTc permitiría determinar la topografía en
donde se observa un aumento de la expresión de IL-
6, con la consecuente posibilidad que esté asociado
a un proceso infeccioso u neoplásico. De esta forma
se podría emplear como un potencial agente imagen
molecular para evaluar localización y extensión de la
lesión, así como para el seguimiento de pacientes con
Mieloma Múltiple.
METODOLOGÍA
Derivatización, marcación y controles De caliDaD Hynic-tcz
con 99mtc
Tocilizumab (Actemra®) 20 mg/mL producido por
Genentech, Inc., fue proporcionado por Laboratorios
Roche. La reacción de conjugación se inició por adición
de 33 µL de NaHCO3 1M a 0.067 µmol de TCZ. Luego
se añadió 0.33 µmol de Suc-HYNIC en 7.1 μL DMSO
(J. T. Baker). La mezcla se incubó a 18 – 25 ºC por 30
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minutos en oscuridad, pH 8. El conjugado se puricó,
para separar el HYNIC libre, por cromatografía de
exclusión molecular utilizando una columna Sephadex
G-25 (SEC) (PD-10, Amersham Biosciences). Se realizó
MALDI-TOF/TOF 4800 (Abi Sciex) para determinar la
relación de conjugación de HYNIC con el TCZ.
Para lograr óptimas condiciones de marcado, se disolvió
44.6 µmol de tricina (N-[Tris(hidroximethil)-metiyl]glicina,
Sigma) en 0.8 mL de agua, se ajustó el pH a 4.5 - 5 con
0,05 mL de HCl 2.0 M (solución A). En un segundo vial
se disolvió 44.3 µmols de SnCl2.2H2O (J. T. Baker) en
0.5 mL HCl 2.0 M y 0.05 mL de esta solución se adicionó
al vial de tricina. Finalmente se ajustó el volumen a
10 mL con solución NaCl 0,9 % (solución B). 25 μL
de la solución B se adicionó a 0.067 µmol de HYNIC-
tocilizumab, e inmediatamente se adicionó Na99mTcO4
(Generador TecnoNuclear 99Mo-99mTc), no más de 1
mL. La mezcla se incubó a temperatura ambiente (20-
25 °C) durante 30 minutos.
La pureza radioquímica (PRQ) fue evaluada utilizando
cromatografía de exclusión molecular (SEC). Se
utilizaron sistemas cromatrográcos ITLC-SG (Pall
Corporation) y NaCl 0,9 % ([Rf=0, 99mTcO2.H2O y 99mTc-
HYNIC-TCZ], [Rf=1, 99mTc-tricina y 99mTcO4-]); ITLC-SG
embebido en albúmina de suero bovino (BSA, Sigma-
Aldrich) y EtOH:NH3:H2O (2:1:5) ([Rf=0, 99mTcO2.H2O],
[Rf=1 99mTc-tricina, 99mTcO4- y 99mTc-HYNIC-TCZ]), y
papel Whatman Nº1 (Whatman International Ltd) y MEK
([Rf=0, 99mTcO2.H2O, 99mTc-tricina y 99mTc-HYNIC-TCZ],
[Rf=1, 99mTcO4-]) como fases estacionarias y móviles
respectivamente. Los niveles de actividad se midieron
luego de la incubación en un contador de centelleo
sólido Capintec CRC7 con detector de cristal “3x3” de
NaI(Tl) asociado a un analizador multicanal ORTEC.
También se evaluó la PRQ por HPLC (Agilent 1200,
Agilent Technologies, Italia) utilizando una columna
Protein-Pak SEC, 300 Å, µm, 7.5mm X 300 mm,
10K-500K (Waters Corporation), modo isocrático, con
buffer fosfato 0,1 M, pH 7,0, ujo 1ml/min, equipado con
detectores UV y NaI (TI).
marcación y controles De caliDaD De tcz a través De (co)3
con 99mtc
Se adicionó 1 ml de 99mTcO4- al kit de Isolink TM
(Mallincrodt, USA).Se calentó en baño de agua
hirviendo durante 20 minutos. Después de enfriar a
temperatura ambiente la solución se ajusta a pH 7,0
con HCl 0,2 N. Para el marcado se agregan 74 MBq de
[99mTc(CO)3(OH2)3]+ a 1 mg de TCZ, se incubó la mezcla
en solución a temperatura ambiente durante 40 minutos
a 37 ° C.
En este caso la PRQ fue evaluada igualmente por SEC
y HPLC. Se utilizó el sistemas cromatográco ITLC-SG y
NaCl 0,9 % (Rf=0, [99mTc(CO)3-TCZ], Rf=1, [99mTc(CO)3)]
como fases estacionarias y móviles respectivamente.
Las condiciones de medida y de HPLC utilizadas fueron
las mismas que para el marcado vía HYNIC.
estuDios De estabiliDaD in-vitro
Para estudiar la estabilidad de los radiomarcados se
realizaron estudios in-vitro desaando la transquelación
del 99mTc a distintas condiciones. Para ambos casos
los estudios fueron analizados por HPLC, con las
condiciones mencionadas anteriormente, a 1, 4 y 24 H.
Para el conjugado 99mTc-HYNIC-TCZ se estudió la
estabilidad en solución de NaCl 0.9 %, suero fetal
bovino (SFB), PBS y L-Cisteína a dos concentraciones
diferentes, 0.1 y 1 mM a 37 ºC. Para el radiomarcado
99mTc(CO)3-TCZ se realizó una comparación de la
estabilidad en solución NaCl 0.9 % a 25 y 37ºC. También
se analizó la estabilidad en SFB a 37ºC.
caracterización farmacológica en ratones normales balb/c.
Todos los protocolos de trabajo utilizados con ratones
fueron sometidos previamente a aprobación por el
Comité Nacional de Experimentación Nacional (CHEA,
Uruguay). Se utilizaron ratones Balb/C normales de seis
semanas (n = 3 por grupo), los cuales fueron inyectados
por la vena de la cola con aproximadamente 1,8 MBq de
99mTc-TCZ, para ambos agentes quelantes. Los animales
fueron sacricados por dislocación cervical después
de las 4, 16 y 24 h de inyección para el radiomarcado
99mTc-HYNIC-TCZ y a 1, 4 y 24 hs para el radiomarcado
99mTc-(CO)3-TCZ. Se seleccionaron los tejidos: corazón,
hígado, pulmones, bazo, tiroides, riñones, músculos,
huesos, estómago, tracto intestinal (TI) y vejiga). Se
enjuagó la sangre residual y se midió su actividad en
un detector de NaI (Tl). La orina y la sangre, también
se recogieron y se midió su actividad. Se expresó la
Publicación de la DNSFFAA
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captación como porcentaje de dosis inyectada (% DI) y
dosis inyectada por gramo de tejido (% DI/g).
imágenes De microscopía confocal
Esta técnica se utilizó para observar la unión del TCZ
a los antígenos de la membrana plasmática de células
U266. Para obtener imágenes de uorescencia se
realizó primero la conjugación FITC-Tocilizumab y luego
se analiza en el microscopio de orescencia.
estuDios in-vitro De unión celular
Los estudios de unión se llevaron a cabo utilizando la
línea celular de MM U266 (ATCC) que sobre-expresan
el receptor de IL-6. Las células fueron cultivadas en
medio de cultivo PBS (7.4) durante dos semanas. El
número de células se determinó por citometría de ujo,
1x106 células/ml de medio de cultivo se fraccionaron de
a 1ml. Luego se adicionan 20 µl de radiomarcado (1 µCi/
tubo) y se incubaron a 37 ºC durante 30, 60 y 120.
Paralelamente se realizó un ensayo de desplazamiento
para poder determinar la unión especíca del TCZ a
los antígenos, IL-6R, expresados en la membrana de
las células. Dicho ensayo se llevo a cabo incubando
conjuntamente durante 120 minutos 1x106 células/ml
con 1 ml (20 µg/ml) de TCZ no marcado y con 20 µl de
radiomarcado a una concentración nal de 55 nM.
Una vez transcurridos los tiempos de incubación, las
células fueron centrifugadas tres veces por 3 minutos
a 3000g, el sobrenadante es aspirado y el pellet
conteniendo las células es lavado dos veces con PBS
0,5 M. Cada ensayo se llevó a cabo por triplicado.
Finalmente se midieron todas las muestras juntas por
detección gamma al nalizar el ensayo en el contador
PICKER COMPAC 120 CPM.
análisis estaDístico
Los resultados se expresaron como media ± error
estándar. El análisis estadístico se realizó mediante la
prueba no apareada t. Fue considerado signicativo un
valor de p ≤ 0,05.
RESULTADOS
Derivatización, marcación y controles De caliDaD Hynic-tcz con 99mtc
Suc-HYNIC fue conjugado con TCZ a temperatura
ambiente por 30 min. Se utilizó una columna PD10
para separar el HYNIC-TCZ conjugado del HYNIC libre.
Más del 90% de la cantidad inicial de anticuerpo fue
recuperado según lo que se monitoreo por absorbancia
UV a 280 nm usando un coeciente de extinción molar
de 1.4.
La relación m/z para el HYNIC-TCZ (MH+)2+ fue de
148.590 y para el TCZ (M+) fue de 147.626. Con las
masas obtenidas por MALDI-TOF y usando como
referencia la masa de HYNIC, se determinó que están
unidos, un promedio de cuatro moléculas HYNIC por
molécula de anticuerpo (Figura 1A y 1B).
Figura 1. A. Espectrometría de masa MALDI-TOF de Tocilizumab, se observa el pico correspondiente al anticuerpo a los 147.626 Da. B. MALDI-TOF de HYNIC-Tocilizumab, se
observa el pico correspondiente al conjugado a los 148.590 Da.
Las condiciones óptimas de marcado de HYNIC-TCZ fueron determinados examinando diferentes concentraciones de
tricina y SnCl2.2H2O en la reacción de marcado. La eciencia de marcado de anticuerpo obtenido fue de 92.0 ± 4 %
con una relación de radio molar de tricina/SnCl2 9:10. El rendimiento de marcado fue conrmado por SEC y HPLC. El
99mTc-HYNIC-TCZ se eluyó a 3 – 4 mL y el 99mTcO4- y 99mTc-Tricine libre a 7 – 8 mL en una columna PD-10 con solución
salina.
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La caracterización por HPLC mostrada como tiempo
de retención (Rt) para el Tocilizumab sin marcar fue
de 7.73 min determinado por detección UV (Figura 2).
A su vez se determinó el Rt para 99mTc-HYNIC-TCZ,
el cual fue de 7,83 min, tanto por detección UV como
gamma (Figura 3A y 3B). Se observaron además, en
el espectro gamma, pequeños picos con Rt 11,85
y 13,18 min. A n de determinar las identidades de
estos picos se realizaron controles de 99mTcO4-, TCZ-
HYNIC y tricina libre mostrando Rut de 13,15, 7,17
y 12,38 min, respectivamente. Por tanto los picos
observados corresponden a tricina y 99mTcO4
-. La PRQ
determinada por el área del pico correspondiente
al conjugado marcado fue de 92%, repitiéndose el
porcentaje de PRQ obtenido mediante SEC.
Posteriormente el marcado se puricó y se obtuvo un
único pico con un Rt de 7,85.
Figura 2. Espectro UV obtenido por HPLC para el Tocilizumab sin marcar, Rt = 7.73 min.
Figura 3A y 3B. En la g 3A - Espectro UV obtenido por HPLC de 99mTc-HYNIC-TCZ Rt = 7.83 min. En la g 3B - Espectro gamma obtenido por HPLC de de 99mTc-HYNIC-
TCZ, Rt = 7.83 min. También se observan pequeños picos con Rt = 11.85 y 13.18 min, correspondientes a tricina y de 99mTcO4- sin conjugar
marcación y controles De caliDaD De tcz con 99mtc(co)3
La eciencia de marcado del anticuerpo fue determinada por SEC y HPLC. La PRQ obtenido por SEC fue de 95 ± 5
%. La caracterización por HPLC mostrada como tiempo de retención para el 99mTc(CO)3-TCZ fue de 7,93 min, en el
espectro UV y gamma (Figura 4A y 4B). Para este marcado se realizó control de [99mTc(CO)3]+ mostrando un Rt de
12,38. (Figura 5)
Publicación de la DNSFFAA
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estuDios De estabiliDaD in-vitro
Los estudió de estabilidad in-vitro para el sistema
99mTc-HYNIC-TCZ en solución de NaCl 0.9% a 37 ºC
muestran que un 96 % del 99mTc permanece unido al
anticuerpo hasta 24 hs post incubación. Respecto a
la transquelación del 99mTc con concentraciones de
L-cisteína de 0.1 mM y 1 mM los resultados muestran
que hasta 94% y 83% respectivamente del 99mTc
permanece unido al anticuerpo. Los resultados para
la incubación con SFB y PBS no revelaron niveles de
transquelación signicativos, en este caso un 96% del
radionucleido permanece unido (Tabla 1).
Estudio por HPLC de estabilidad in-vitro de
99mTc-HYNIC-Tocilizumab
Tiempo
(hs)
NaCl 0.9 %
37º PBS L-Cisteína
0,1 mM
L-Cisteína
1 mM SFB
1 100 97 90 91 100
4 96 96 94 89 100
24 98 -- -- 83 96
Tabla 1
En la tabla 2 se muestran los resultados del estudio de
estabilidad para el marcado vía tricarbonilo. De esto se
observó que la reacción de marcado es dependiente
de la temperatura, siendo mayormente favorecido
cuando el marcado se realiza a 37ºC, comparada a la
marcación realizada a temperatura ambiente (25ºC),
especialmente a cortos períodos de incubación. Para
una hora de incubación la PRQ fue de 94% a 37ºC y
49% a 25ºC. Sin embargo al transcurrir 24 hs las PRQ
son equiparables, siendo de 97 y 93 % para 37 y 25ºC
respectivamente.
Los resultados en suero a 37ºC muestran una
disminución de la PRQ conforme avanza el tiempo,
reduciéndose la misma en un 18%, al compararla con
las condiciones ideales de NaCl 0.9% a 37ºC.
Estudio de estabilidad de [99mTc(CO)3(OH2)3]-TCZ en solución
salina a 37°C y 25°C y en suero (SFB) a 37°C
Tiempo (hs) NaCl 0.9 %
37º
NaCl 0.9 %
25º SFB
1 94 49 91
2 94 34 85
3 95 79 84
24 97 93 71
Tabla 2
Figura 4A y 4B. Espectro UV y gamma respectivamente obtenido por HPLC de 99mTc-(CO)3-TCZ, Rt = 7,93 min
Figura 5. Espectro gamma obtenido por HPLC de [99mTc-(CO)3]+, Rt = 12.38 min.
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caracterización farmacológica en ratones normales balb/c.
Los resultados de la caracterización farmacológica
se muestran en la tabla 3 y 4 para 99mTc-HYNIC-TCZ,
99mTc(CO)3-TCZ respectivamente.
En primer lugar para 99mTc-HYNIC-TCZ se observó
captación hepática y una lenta depuración sanguínea,
con eliminación renal y hepática. La retención de
conjugado se observó tanto en hígado como en riñón, lo
que sugiere un metabolismo mixto hepatobiliar/renal de
este radiotrazador. La actividad en el riñón fue de 5,16
± 0,36, 3,24 ± 0,66, y 3,62 ± 0,59 % DI/g a 4, 16 y 24 h,
respectivamente. Estos datos fueron acompañados por
un alto porcentaje de dosis inyectada en intestino y orina.
A las 24 h, 32,80 ± 2,41 %DI de 99mTc-HYNIC-TCZ fue
eliminado en la orina, que incluye orina recogida y vejiga,
y el 7,70 ± 0,90 %DI fue detectado en los intestinos. Los
niveles de radiactividad en sangre fueron 8,65 ± 0,64,
6,59 ± 2,53, y 7,31 ± 0,57 % DI/g a 4, 16 y 24 horas
seguidas, lo que indica una depuración de la sangre 24
horas después de la inyección del anticuerpo marcado.
En el caso del conjugado 99mTc(CO)3-TCZ los tiempos
evaluados fueron de 1, 4 y 24 horas. Los resultados
muestran un comportamiento similar al derivatizado vía
HYNIC. La actividad en el riñón fue de 10,51 ± 4,04, 3,78
± 1,43 y 2,72 ± 0,66 % DI/g a 1, 4 y 24 h, respectivamente.
A las 24 h, 59,95 ± 6,48 %DI de radiotrazador fue
eliminado en la orina y el 4,73 ± 0,63 %DI se detectó en
los intestinos. Los niveles de radiactividad sanguínea
fueron 28,23 ± 4,10, 5,63 ± 1,23 y 4,49 ± 0,48 % DI/g a 1,
4 y 24 horas, lo que conrma una adecuada depuración
sanguínea después de 24 horas.
A pesar de las altas actividades en sangre detectadas para
ambos radiomarcados, se vericó la baja acumulación en
varios tejidos no especícos. Menos del 4 % DI/g se ha
detectado en bazo, tiroides, músculos, huesos, estómago
y tracto intestinal en todos los tiempos analizados para
ambos conjugados marcados.
Estudios farmacocinéticos de 99mTc-HYNIC-Tocilizumab en ratones
Balb/C normales.
4 h 16 h 24 h
Porcentaje de dosis inyectada/gramo (%ID/g)*
SANGRE 8,65 ± 0,64 6,59 ± 2,53 7,31 ± 0,57
HÍGADO 3,02 ± 0,12 5,31 ± 0,39 7,13 ± 1,50
CORAZÓN 2,65 ± 0,07 1,50 ± 0,31 2,45 ± 0,50
PULMON 2,54 ± 0,39 3,08 ± 0,81 3,52 ± 1,44
BAZO 2,49 ± 0,03 1,26 ± 0,18 2,75 ± 0,64
RIÑONES 5,16 ± 0,36 3,24 ± 0,66 3,62 ± 0,59
TIROIDES 2,23 ± 0,11 1,42 ± 0,38 2,36 ± 0,28
MUSCULO 0,51 ± 0,07 0,32 ± 0,10 0,57 ± 0,16
HUESO 0,69 ± 0,15 0,87 ± 0,16 0,81 ± 0,37
ESTOMAGO 1,43 ± 0,37 2,53 ± 1,08 2,13 ± 1,21
TI 2,15 ± 0,25 2,73 ± 0,65 3,38 ± 0,69
Porcentaje de dosis inyectada (%ID)*
INTESTINO 3,08 ± 1,42 2,87 ± 0,50 7,70 ± 0,90
ORINA + VEJIGA 10,93 ± 5,93 26,72 ± 7,49 32,80 ± 2,41
Tabla 3 (* Los datos se presentan como %ID/g (o %ID) desviación estándar (n=3)
TI=Tracto Intestinal)
Estudios farmacocinéticos de [99mTc(CO)3(OH2)3]-Tocilizumab en
ratones Balb/C normales.
1 h 4 h 24 h
Porcentaje de dosis inyectada/gramo (%ID/g)*
SANGRE 28,23 ± 4,10 5,63 ± 1,23 4,49 ± 0,48
HÍGADO 9,03 ± 2,44 2,80 ± 0,92 3,41 ± 0,37
CORAZÓN 10,10 ± 3,46 1,59 ± 0,58 1,53 ± 0,24
PULMON 10,28 ± 2,98 1,90 ± 0,31 1,88 ± 0,45
BAZO 0,85 ± 0,51 1,21 ± 0,41 1,29 ± 0,24
RIÑONES 10,51 ± 4,04 3,78 ± 1,43 2,72 ± 0,66
TIROIDES 2,12 ± 1,58 1,17 ± 0,47 1,77 ± 0,45
MUSCULO 0,78 ± 0,16 0,57 ± 0,70 0,46 ± 0,18
HUESO 1,71 ± 0,29 1,02 ± 1,26 0,65 ± 0,23
ESTOMAGO 1,75 ± 0,74 1,40 ± 0,76 0,73 ± 0,14
TI 2,21 ± 0,47 0,98 ± 0,41 1,77 ± 0,17
Porcentaje de dosis inyectada (%ID)*
INTESTINO 4,59 ± 1,11 2,08 ± 0,79 4,73 ± 0,63
ORINA +
VEJIGA 10,85 ± 3,38 13,88 ± 3,82 59,95 ± 6,48
Tabla 4 (* Los datos se presentan como %ID/g (o %ID) desviación estándar (n=3)
TI=Tracto Intestinal)
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Salud Militar Vol. 31 Nº 1 Año 2012 17
imágenes De microscopia confocal
En la Figura 6 se muestran las imágenes del ensayo
de unión de FITC-TCZ a los antígenos de membrana
de las células U266. Se puede observar la unión ecaz
del anticuerpo a los mIL-6R y también se observa
anticuerpo internalizado.
Figura 6. Imágenes obtenidas por microscopia de uorescencia confocal, se
observa la unión de FITC-Tocilizumab a las membranas de las células U266, las
cuales expresan el mIL-6R.
estuDios in-vitro De unión celular.
Los resultados in-vitro realizados muestran la unión
de ambos marcados a las células U266 a 60 y 120
min para 99mTc-HYNIC-TCZ y 30, 60 y 120 min para
99mTc(CO)3-TCZ.
En los ensayos de desplazamiento, de ambos
radiomarcados, se registró una disminución de más del
50% de la actividad como resultado del bloqueo ecaz
de del anticuerpo (Figura 7A y 7B).
Figura 7A y 7B. Ensayo en células de unión y desplazamiento para
99mTc-HYNIC-Tocilizumab y 99mTc(CO)3-Tocilizumab respectivamente
DISCUSIÓN
El Tocilizumab es un anticuerpo monoclonal que se
une a los receptores de IL-6. La IL-6 es una de las
principales moléculas involucradas en la patogenia del
MM. se han encontrado que niveles elevados de IL-6
están directamente relacionados con el crecimiento,
supervivencia y proliferación de células de MM. De
esta forma la marcación del Tocilizumab con un emisor
gamma, como el 99mTc, se podría emplear como método
diagnóstico para evaluar localización de la lesión y
extensión, así como para el seguimiento de pacientes
con MM.
El objetivo del presente trabajo fue la marcación de
Tocilizumab con 99mTc mediante dos vías; agente
bifuncional HYNIC y el organometálico (CO3).
Posteriormente se realizó la evaluación radioquímica y
biológica a través de diferentes ensayos.
Es muy importante en la marcación de moléculas blanco
con radionucleidos metálicos que retengan la actividad
biológica de la biomolécula. El grupo 6-hidrazinonicotinil,
conocido como HYNIC, es uno de los agente quelantes
bifuncionales más utilizados (19). A su vez el 99mTc(CO3)
representa un excelente precursor para el marcado de
biomoléculas, como los anticuerpos, resultando en
un complejo muy estable y compacto que no causa
impedimento estérico con los sitios de unión del
anticuerpo (20).
Como se mencionó la mayoría de los radiofármacos
que están clínicamente disponibles en Medicina
Nuclear son complejos de 99mTc debido a las favorables
características sicoquímicas de este radionucleido para
la realización de imágenes centellográcas. Además, el
99mTc es fácilmente disponible y a bajos costos a partir
de generadores de 99Mo-99mTc.
Inicialmente los resultados obtenidos por espectrometría
de masa MALDI-TOF, conrman la derivatización
del anticuerpo y nos permiten estimar el número de
moléculas de BFC por anticuerpo. Al evaluarse los
pesos moleculares (M+) para el Tocilizumab y HYNIC-
Tocilizumab, se obtuvo una relación anticuerpo:HYNIC
de aproximadamente 1:4. Estos resultados signican
una alta conjugación por parte del anticuerpo al quelante
bifuncional, lo que posibilitaría obtener altas actividades
99mTc-Tocilizumab un nuevo agente de imagen molecular en Mieloma Múltiple
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especícas.
Ambas marcaciones con 99mTc se desarrollaron de
forma rápida y sencilla, presentado altas purezas
radioquímicas, según se pudo evaluar por distintos
sistemas cromatográcos. Complementariamente los
resultados obtenidos por HPLC muestran un marcado
estable que no parece afectar la integridad del anticuerpo
y sin presencia de agregados proteicos.
La estabilidad in-vitro de los radiomarcados, evaluadas
como porcentaje de PRQ, mostraron altos niveles de
pureza en todas las condiciones estudiadas. Para el
marcado vía HYNIC, el estudio realizado con el agente
de competencia L-Cisteína mostró una disminución
de la estabilidad en un 15% para concentraciones de
1mM, mientras que a 0,1mM no se observo cambio
en la PRQ. Estos resultados son esperados dado
que la L-Cisteína es un agente de competencia que a
concentraciones altas resulta un competidor muy potente
por el radionucleido 99mTc formando complejos muy
estables con el mismo. Por otro lado se pudo apreciar,
comparando la PRQ obtenida a 25 y 37ºC, como se ve
favorecida la marcación para el agente organometálico,
con el aumento de temperatura. Finalmente se estudió
la estabilidad de ambos marcados en suero; para el
marcado vía HYNIC se observó que se mantiene una alta
estabilidad hasta 24 hs, mientras que vía tricarbonilo la
estabilidad disminuye en un 18% transcurrido el mismo
tiempo de incubación.
Por otro lado, se realizaron estudios para determinar el
perl farmacocinético del Tocilizumab marcado mediante
la realización de biodistribución con ratones Balb/C
normales. Para el 99mTc-HYNIC-TCZ se realizaron a
4, 16 y 24 H y para 99mTc(CO)3-TCZ a 1, 4 y 24 hs.
Ambos radioconjugados presentaron el mismo perl
farmacocinético, se observó una lenta depuración
sanguínea, con eliminación hepática principalmente y en
menor medida renal, y ausencia de captación apreciable
en otros órganos. La eliminación renal, se sabe que es
debido a productos de metabolización del anticuerpo los
que pueden ser ltrados por el glomérulo renal unidos a
radionucleido.
Las imágenes obtenidas mediante microscopía láser
confocal muestran la efectiva unión entre el FITC-TCZ
a los antígenos de membrana de las células U266, las
cuales expresan mIL-6R. Además se observa que FITC-
TCZ internalizado por lo que probablemente el mIL-6R
es un receptor de membrana internalizable una vez se
une al anticuerpo.
Finalmente en los ensayos de unión en células U266,
para ambos radiomarcados, se observó la efectiva
unión de los radiomarcados a la línea celular de MM.
Adicionalmente en el ensayo de desplazamiento se
observó más del 50 % del marcado desplazado por el
anticuerpo frío (bloqueo). Estos resultados nos indican
la alta especicidad de unión que existe de los marcados
y nos permiten concluir que luego de derivatizado
y marcado el anticuerpo por ambas vías, sigue
manteniendo su actividad biológica y no se ve afectada
la capacidad de unión al antígeno de membrana en las
células ensayadas.
CONCLUSIONES
Tocilizumab fue marcado con 99mTc a través de
ambas estrategias obteniéndose buena estabilidad,
PQR y especicidad in-vitro e in-vivo. Tanto
99mTc(CO)3-Tocilizumab como 99mTc-HYNIC-Tocilizumab
pueden ser potenciales agentes de imagen molecular
en MM.
AGRADECIMIENTOS
Los autores quisieran agradecer a G. Arroyo y a Roche®
por proporcionarnos el Tocilizumab (Actemra®).
Este trabajo fue apoyado por la Agencia Nacional de
Investigación e Innovación (ANII, Uruguay) por una
beca a E. Gutiérrez. No existen conictos de intereses.
SUMMARY
Il6 is a key molecule in the pathogenesis of MM.
Tocilizumab is a monoclonal antibody against IL6R. In
our work we conjugate 99mTc-Tocilizumab using two
different chelators (HYNIC and tricarbonyl). Tocilizumab
was derivatized with HYNIC and labeled using 99mTc/
tricine/SnCI2 at room temperature, incubated during
45 min. PQR was assessed by ITLC-SG and HPLC. In
vitro studies were carried out up to 120 min. Fluorescent
and atomic force microscopy images were obtained
with U266 MM cells. In vivo studies were carried out in
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Salud Militar Vol. 31 Nº 1 Año 2012 19
normal Cd1 mice (N=3).
Radiochemical purity was >90% using both chelators,
remaining stable with no signicant transchelation
during 24 h. Confocal microscopy showed the ability of
TCZ-FITC to recognize IL6R in U266 cells. Specicity of
union of 99mTc-Tocilizumab to IL6R was demonstrated
by in vitro competitive experiments. Biodistribution
studies showed liver uptake and renal elimination. We
conclude that labeling 99mTc-TCZ is performed by booth
strategies with high RQP and specicity of binding, so
the could become potential imaging agents for diagnosis
of MM.
Key Words: MULTIPLE MYELOMA
TOCILIZUMAB; IL-6 RECL;
IL-6 FAMILY CYTOKINE
TRICARBONILO
HYNIC
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